PartI羟基喜树碱、顺铂联合热疗抑制人肝癌细胞

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1、Part I 羟基喜树碱、顺铂联合热疗抑制人肝癌细胞SMMC-7721体外增殖作用的研究The research on the combination of chemotherapy and hyperthermia against hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 in vitro摘要：【背景】热疗是通过加热使肿瘤组织的温度达到4044，引起肿瘤细胞生长受阻与死亡的一种治疗方式，热疗对细胞的杀伤作用取决于热疗的温度及热疗的时间。联合应用热疗与化疗是一种合理的综合治疗方案，热疗能促进药物进入肿瘤细胞；促进药物诱发的肿瘤细胞凋亡；肿瘤组织中

2、心部位达到较高温度时的酸性环境易诱发肿瘤细胞凋亡。【目的】本实验旨在国内外现有的研究基础上，探讨数种抗肿瘤药物联合热疗体外抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖的效果，以确定联合方案是否具有协同效应。【方法】本实验使用MTT法测定单独或联合应用化疗药物羟基喜树碱或顺铂与热疗对人肝癌SMMC-7721细胞的体外增殖的抑制作用，使用流式细胞仪检测了不同方案对SMMC-7721细胞凋亡率的影响。【结果】结果表明，联合应用热疗可以显著提高化疗药物顺铂或羟基喜树碱引起的细胞增殖抑制及细胞凋亡。以亚毒性剂量浓度的顺铂为例，对照组、化疗组、热疗组、热化疗组的细胞增殖抑制率分别为0%、20.77%、32.46%

3、、62.76%；细胞倍增时间分别为40.54h、50.30h、106.85h、166.07h；细胞凋亡率分别为2.19%、10.56%、15.16%、34.32%。【结论】联合应用热疗与化疗药物羟基喜树碱或顺铂，对SMMC-7721细胞体外增殖的抑制及诱导细胞凋亡的能力具有显著的协同作用。【关键词】：热疗；顺铂；羟基喜树碱；SMMC-7721细胞株Abstract: 【Background】Hyperthermia is an attractive addition to multidisciplinary approaches to clinical cancer treatment. Th

4、e quantitative and reproducible effect of hyperthermia depends on the elevation of temperature and the duration of treatment. It has been reported that in vitro and in vivo hyperthermia can enhance the cytotoxic effect of certain anticancer drugs that have different mechanisms of action. Hyperthermi

5、a combined with chemotherapy is a logical and potentially powerful treatment. The magnitude of the enhancement varies according to different drugs and the scheduling of drugs with heat.【Objectives】This experiment aims to investigate whether concurrent exposure of human hepatocellular carcinoma cells

6、 SMMC-7721 to chemotherapeutic agents with hyperthermia will increase anticancer effects.【Methods】In our study, we applied two chemotherapeutic agents such as cisplatin, and hydroxycamptothecin. The MTT assay has been developed for quantitative evaluation of the proliferation of SMMC-7721 and cytoto

7、xicity of anticancer drug with or without hyperthermia. Flow cytometric analyses were used for the assessment of apoptosis rates after treatment.【Results】The combination treatments induced significantly higher apoptosis and cytotoxicity than exposure to 43 hyperthermia alone or anticancer drugs alon

8、e.【Conclusion】While both hyperthermia and anticancer drugs can individually induce apoptosis and anti-proliferation effect, they may offer synergistic benefits when used concurrently.【Keywords】hyperthermia; hydroxycamptothecin; cisplatin; SMMC-77210 引言全世界每年约有700万人死于癌症，是人类死亡的第二位原因。目前恶性肿瘤的治疗主要依靠手术治疗、放

9、射治疗、化学治疗、生物治疗等。热疗（hyperthermia）是通过加热使肿瘤组织的温度达到4044，引起肿瘤细胞生长受阻与死亡的一种治疗方式。虽然人类自有了文明以来就在实践中懂得了用热来治疗疾病，肿瘤热疗的历史也可以追溯到一百年以前或更长时间，但真正用科学的方法来研究热疗还不到30年，主要成果集中于热疗使放疗或化疗增敏，近年来肿瘤热疗有了很大发展，已完成的一些II期或III期临床研究都表明肿瘤热疗可使食管癌、膀胱癌、宫颈癌、软组织肿瘤、骨肉瘤等肿瘤的治疗增效。肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，早期发现困难，临床病程短，进展迅速，中位生存期仅36个月。治疗上以手术切除为主，但多数患者确诊时已

10、丧失手术时机。非手术治疗以肝动脉栓塞化疗为首选，经皮肝穿瘤体内冷冻、射频、无水乙醇及抗癌药物注射治疗也有一定效果，针对肝癌常选用的化疗药物有顺铂、阿霉素、丝裂霉素、羟基喜树碱等，但肝癌治疗的疗效及预后均较差，有待于寻找具有更好效果的新的药物或方案1。近十余年来，新的抗肿瘤药物不断应用于肿瘤治疗，同时也不断有研究发现，有些化疗药物与热疗联合具有显著的协同作用。但热化疗联合处理肝癌细胞的研究国内外均未见报道。本研究中，我们将单独或联合使用化疗药物及热疗，观察不同方案对人肝癌SMMC-7721细胞体外增殖的抑制作用，以明确化疗药物与热疗联合应用是否具有协同效应。1 材料与方法1.1. 细胞株人肝癌细

11、胞株SMMC-7721系本实验室常规培养，生长于含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培养液中，37恒温，5%CO2，饱和湿度培养箱中生长。取对数生长期细胞用于实验。1.2. 试剂RPMI 1640系GIBCO公司产品，内含2mM L-谷氨酰胺，25mM HEPES，此外配制完全培养液还需：1mM 丙酮酸，1mM 丁酮二酸，2g/L 碳酸氢钠，均为SIGMA公司产品；200u/L 中性胰岛素注射液系江苏万邦公司产品；60mg/L 硫酸阿米卡星系齐鲁制药厂产品。新生牛血清系杭州四季青公司产品。胰蛋白酶系SIGMA公司产品，以1640培养液配置成0.25%浓度备用。顺铂注射液系江苏豪森公司产品

12、。注射用羟基喜数碱系湖北李时珍药业公司产品。以上药物均稀释至实验用最高浓度的10倍浓度备用。四甲基偶氮唑盐（MTT）系SIGMA公司产品，用超纯水配制成5mg/ml浓度（不含酚红）。二甲基亚砜（DMSO）系上海凌峰公司产品。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒系BD公司产品。1.3. MTT法测细胞增殖取对数生长期的SMMC-7721细胞用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液稀释至一定浓度接种于96孔培养板，每孔200l，细胞5103个/孔，置于37恒温，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养24h后分别或同时给予化疗药物及加热处理，继续培养20h，加入MTT 20l，再继续培养4h，

13、吸去上清培养液，加入200l DMSO，在微型震荡器上震荡5min，将培养板置于酶标仪上，以620nm为参考波长，490nm为试验波长测定吸收值A，计算各复孔的平均值，减去空白对照孔平均值。细胞增殖抑制率 = （ 对照组OD值 实验组OD值 ） / 对照组OD值 100%。采用Weeb系数2来判定联合应用化疗药物及热疗的相互作用，预估效应C = A B，其中A、B分别指化疗或加热后的细胞生存率，生存率 = 实验组OD值 / 对照组OD值 100%，当实际生存率70%预估效应时，联合处理即表现出协同作用。1.3.1. 化疗药物亚细胞毒剂量浓度的测定 分别测定顺铂及羟基喜树碱对SMMC-7721细

14、胞的亚细胞毒剂量浓度。每种药物设6个浓度组，每组3个复孔，顺铂的最终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125g/ml，羟基喜树碱的最终浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125g/ml。以MTT法测细胞增殖抑制率，选择抑制率分别为1020%的浓度为该药物的亚细胞毒剂量浓度，顺铂为10g/ml，羟基喜树碱为1g/ml。1.3.2. 热化疗联合对细胞增殖抑制效果的测定 分别设化疗组及热化疗组，化疗组内设7组，分别为对照组及高、中、低3个不同浓度的顺铂及羟基喜树碱组，顺铂的最终浓度分别为100、10、1g/ml，羟基喜树碱的最终浓度分别为10、1、0.1g/m

15、l，热化疗组内也设7组，分别为热疗组及相对应的热化疗组，化疗药物浓度同化疗组。每组均设3个复孔。给药后热化疗组立刻放入电热恒温水浴箱中43作用30min，然后移至37恒温，5%CO2，饱和湿度培养箱中继续培养。给药后24h以MTT法测细胞增殖抑制率，以Weeb系数判定热化疗的联合作用。1.3.3. 热化疗细胞生长曲线的测定 分别设化疗组及热化疗组，各重复3次，分别用以测定给药后24h、48h、72h时的细胞增殖水平。化疗组中设对照组、顺铂组及羟基喜树碱组，顺铂的最终浓度为10g/ml，羟基喜树碱的最终浓度为1g/ml，热化疗组设热疗组、顺铂加热疗组及羟基喜树碱加热疗组，化疗药物最终浓度同对应化

16、疗组。每组均设3个复孔。给药后热化疗组立刻放入电热恒温水浴箱中43作用30min，然后移至37恒温，5%CO2，饱和湿度培养箱中继续培养。给药后24h、48h、72h分别以MTT法测定细胞增殖，制作热化疗细胞增殖曲线。根据Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间 = T lg 2 / lg （ Nt / N0 ）。其中N为细胞数，T为细胞数由N0增至Nt所用的时间。1.4. 流式细胞仪法检测细胞凋亡率取对数生长期的SMMC-7721细胞用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液稀释至一定浓度接种于6孔培养板，每孔3ml，细胞3105个/孔，置于37恒温，5%CO2，饱和湿度培养

17、箱中培养24h，取6个孔，分别设为对照孔、顺铂孔、羟基喜树碱孔、热疗孔、顺铂加热疗孔、羟喜加热疗孔，对照孔及热疗孔更换完全培养液，其余各孔给予相应化疗药物，顺铂的最终浓度为10g/ml，羟基喜树碱的最终浓度为1g/ml，给药后需热疗的孔立刻放入电热恒温水浴箱中43作用30min，然后移至37恒温，5%CO2，饱和湿度培养箱中继续培养。给药后24h收集细胞，以冷磷酸缓冲液（PBS）冲洗两遍后用1倍的缓冲液稀释细胞至1106个细胞/ml。吸取100l细胞悬液（含1105个细胞）至5ml培养管中，加入5l annexin V-FITC及5l PI，轻柔地摇动细胞悬液后于室温下避光保存15min，每管

18、加入400l缓冲液混合后上流式细胞仪检测细胞凋亡。 2 结果2.1. 热化疗对细胞增殖的抑制 单独或联合应用化疗药物和/或热疗对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，羟基喜树碱（图1）、顺铂（图2）联合热疗对SMMC-7721细胞增殖的生长抑制曲线如下图所示：图1 羟基喜树碱联合热疗对SMMC-7721细胞的作用Figure 1 Loss of viability of SMMC-7721 by hydroxycamptothecin with hyperthermia图2 顺铂联合热疗对SMMC7721细胞的作用Figure 2 Loss of viability of

19、SMMC-7721 by cisplatin with hyperthermia 采用Weeb系数分别判定羟基喜树碱（表1）、顺铂（表2）联合热疗的相互作用的结果见下表，联合方案的生存率小于70%预估生存率即认为该联合方案具有协同效应。Weeb分析的结果表明高、中、低浓度的羟基喜树碱及高、中浓度的顺铂联合热疗对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用具有显著的协同效应。表1 羟基喜树碱联合热疗的相互作用分析Table 1 Analysis of cooperative effect of combination of hydroxycamptothecin and hyperthermia方案生存

20、率（%）热化疗生存率（%）70%预估生存率（%）热疗 43 30min67.54HCPT 10g/ml67.4716.4730.73HCPT 1g/ml86.3528.1139.32HCPT 0.1g/ml98.3944.1844.81表2 顺铂联合热疗的相互作用分析Table 2 Analysis of cooperative effect of combination of cisplatin and hyperthermia方案生存率（%）热化疗生存率（%）70%预估生存率（%）热疗 43 30min67.54DDP 10g/ml58.4227.3827.62DDP 1g/ml79.23

21、37.2437.46DDP 0.1g/ml96.7560.6145.742.2. 热化疗细胞生长曲线 亚细胞毒剂量浓度的羟基喜树碱（图3）、顺铂（图4）单独或联合热疗对SMMC-7721细胞体外增殖的生长曲线如下图所示：图3 羟基喜树碱联合热疗作用后SMMC-7721细胞生长曲线Figure 3 Proliferation of SMMC-7721 after treatment with hydroxycamptothecin and / or hyperthermia in 3 days图4 顺铂联合热疗作用后SMMC-7721细胞生长曲线Figure 4 Proliferation of

22、 SMMC-7721 after treatment with cisplatin and / or hyperthermia in 3 days 以上结果表明，给予化疗药物或加热后，细胞数减少明显，亚细胞毒剂量浓度的化疗药物与热疗联合应用后细胞数减少更加明显。根据Patterson公式计算细胞倍增时间，对照组、羟基喜树碱组、热疗组、羟喜加热疗组的倍增时间分别为：40.54h、86.35h、106.85h、187.90h，化疗组较对照组延长了1.64倍，热疗组延长了1.13倍，热化疗组延长了3.64倍。顺铂组、顺铂加热疗组的倍增时间分别为：50.30h、166.07h。2.3. 热化疗细胞凋亡

23、率 联合应用热疗能明显增强亚细胞毒浓度的顺铂或羟基喜树碱诱导的SMMC-7721细胞图5 热化疗联合应用后SMMC-7721细胞凋亡率Figure 5 Apoptosis rates of SMMC-7721 after treatment with chemotherapy and / or hyperthermia的凋亡率（图5），热化疗结合时细胞凋亡率显著高于单独热疗或单独化疗时细胞凋亡率（P0.01）。3 讨论在本研究中，我们使用了MTT法测定人肝癌SMMC-7721细胞的体外增殖，以及化疗药物或热疗单独或联合应用对该细胞株体外增殖的抑制作用，另外使用了流式细胞仪检测了热化疗对SMMC

24、-7721细胞凋亡率的影响。综合以上实验结果，联合应用化疗药物羟基喜树碱或顺铂与热疗，对SMMC-7721细胞体外增殖的抑制具有协同作用。但需要说明的是，肿瘤的热化疗具有明显的个体差异。具体来说，不同的药物与热疗联合的协同作用不同，而不同的病种不同的细胞，热化疗的效果也不同。在我们的预实验中筛选了多种化疗药物及免疫治疗药物，结果发现丝裂霉素、健择、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor ，TNF）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）与热疗联合对人肝癌SMMC

25、-7721细胞均没有显著的协同作用。热疗对细胞的杀伤作用取决于热疗的温度及热疗的时间。联合应用热疗与化疗是一种合理的综合治疗方法。，不同的化疗药物与热疗的协同效果并不相同，提示对于特定的药物而言，化疗与热疗的协同作用的机理有一定的特殊性，但有以下共性机理3：（1）热疗促进药物进入肿瘤细胞。（2）热疗促进药物诱发肿瘤细胞凋亡。（3）热疗易使肿瘤组织中心部位达到较高的温度，此时中心部位的酸性环境更易诱发肿瘤细胞凋亡。铂类药物是常用的抗肿瘤药物，在淋巴瘤的根治，乳腺癌的辅助化疗等方案中均占有重要地位。顺铂是铂类药物的原形，主要通过与肿瘤细胞DNA结合引起内部或DNA之间交连和/或DNA与蛋白质之间交

26、连，发挥细胞毒作用。顺铂也是最早发现与热疗有协同作用的药物之一，热疗可以促进DNA与铂的结合，并可使药物到达细胞内的浓度增加，还可以抑制顺铂作用后细胞对DNA的修复过程2。顺铂在4143发挥与热疗的协同效应较为理想。对于顺铂耐药的肿瘤细胞，热疗也能够增加细胞内药物的浓度，有助于克服耐药。顺铂的衍生物卡铂与草酸铂与热疗联合，细胞毒性也有所增加4,5。羟基喜树碱是喜树碱经结构改造后的半成品，作用于细胞分裂的S期，通过抑制拓扑异构酶I发挥抗肿瘤作用。早在1980年我国学者就研究发现喜树碱与热疗联合应用对人食管癌细胞生长有协同作用。单独应用热疗或羟基喜树碱时，细胞生长受阻，但经过大约15天生长又开始活

27、跃起来，两者联合则细胞丧失恢复增殖能力。羟基喜树碱-11（Irinotecan，CPT-11）是羟基喜树碱衍生物，临床上已有采用低剂量CPT-11联合热疗取得理想效果的报道6。综上所述，顺铂与羟基喜树碱联合应用可以显著提高单独热疗或单独化疗对人肝癌细胞SMMC-7721的细胞毒作用，但必须注意的是，实验室研究得出的结论并不能直接应用于复杂的人体，选择合适的抗肿瘤药物、热疗的温度及时间、热化疗的应用顺序将极大地影响其临床效果。同时，关于热疗的一些新的课题，如加温调控的基因治疗、热疗启动的免疫治疗及肿瘤热疗结合热休克蛋白70-抗原肽疫苗的治疗、热增敏剂及携带抗肿瘤药物的热敏脂质体仍然有待于进一步研

28、究解决。参考文献：1 刘宝瑞, 刘文超. 现代肿瘤化疗手册. 西安: 世界图书出版公司, 2000. 107-111.2 Yeh YA, Herenyiova M, Weber G. Quercetin: synergistic action with carboxyamidotriazole in human breast carcinoma cells. Life Sci, 1995, 57(13): 1285-1292.3 刘宝瑞, 钱晓萍. 肿瘤热化疗的基础与临床研究进展. 国外医学肿瘤学分册, 2004, 31(1): 34-37.4 Westermann AM, Wiedemann

29、 GJ, Jager E, et al. A Systemic Hyperthermia Oncologic Working Group trial. Ifosfamide, carboplatin, and Etoposide combined with 41.8 degrees C whole-body hyperthermia for metastatic soft tissue sarcoma. Oncology, 2003, 64(4): 312-321.5 Rietbroek RC, van de Vaart PJ, Haveman J, et al. Hyperthermia e

30、nhances the cytotoxicity and platinum-DNA adduct formation of lobaplatin and oxaliplatin in cultured SW 1573 cells. J Cancer Res Clin Oncol, 1997, 123(1): 6-12.6 Nishida Y, Hamaji M, Miyazaki S, et al. Thermo-chemotherapy using low-dose CPT-11 in a patient with local recurrence of rectal cancer. Gan To Kagaku Ryoho, 1999, 26(4): 549-552.