天然药化薄层色谱

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1、加压薄层色谱法的原理及其应用学科：天然药物化学选论姓名： 谢 燕学号： 2010s407专业：药 剂 学导师：李 建 利2011年7月6 日加压薄层色谱法的原理及其应用摘要：对加压薄层色谱的原理和应用作以介绍。介绍了加压薄层色谱的仪器结构、 工作方式；对影响加压薄层色谱的因素、常见问题及解决方法进行了总结；简要 地介绍了该方法在分析中的应用情况。关键词：加压薄层色谱；原理；应用Principles and Applications of 0Verpressured-Layer ChromatographyAbstract：The principles and applications of o

2、 verpressuredlayer chromatography (0PLC) are reviewed The instrument and the operation modes of 0PLC are introduced，followed by a description of the influence factors of OPLC and how to solve typical problems during the use of 0PLC In addition，the typical applications of OPLC are also summarizedKey

3、words：overpressured-layer chromatography (0PLC)；principles；applications薄层色谱法作为一种快速简便的色谱技术已在中草药分析、毒物分析等众多 领域中广泛应用。在传统薄层色谱法中，展开剂依靠毛细作用通过薄层吸附剂来 完成对组分的分离，因此其分离时间不可控，而且随着展开距离的增加，溶剂前 沿的移动逐渐减慢，被分离组分的扩散也越来越严重。针对此情况，分析学家对 薄层系统进行了改进，发展了薄层色谱的一个重要分支强迫流动薄层色谱 (forced flow planar chromatography, FFPC)。 FFPC 是通过外力强

4、迫展开剂在吸附 剂中运动，它主要有离心薄层色谱法(rotation planar chromatography, RPC)与加 压薄层色谱法(overpressured-layer chromatography， OPLC)两种。RPC 通过高速旋 转产生的离心力加速展开剂的运动；OPLC则依靠加压泵将展开剂直接泵人薄层 板中，并通过泵来调节展开剂的流速1、2。20世纪 60年代出现了薄层色谱超微展开室。这种展开室在展开过程中用一 块玻璃或塑料膜覆盖在薄层板的表面，从而减少了薄层分离中气相的影响。 1979 年Tyihak在超微展开室的基础上，在覆盖薄层板的塑料膜上加以一定的压力，并 将展开剂

5、压人薄层板，从而发展了 0PLC 技术；在此之后，该方法在理论、分析 条件及应用等方面的研究得到了不断的深入，商品化的 0PLC 仪及其专用的薄层 板也不断推出。本文以市售的0PLC仪为例，对OPLC进行介绍。1 仪器结构薄层板夹(cassette)是OPLC技术的关键部分。板夹主要由两层构成，上层为 聚四氟乙烯薄膜层，下层为一块钢板，薄层板吸附剂面向上置于聚四氟乙烯薄膜 与钢板之问。在聚四氟乙烯薄膜两边均有一个小孔，溶剂通过这两个小孔进出薄 层板。在孔的两侧与薄层板接触的一面刻有凹槽，使溶剂可以快速到达薄层板边 缘，从而保证薄层板中间和边缘几乎同时开始展开。在薄层板的边缘有一圈约2 mm 宽

6、的吸附剂被刮掉，再用高分子材料加上一层密封条，以防止加压展开时展 开剂从薄层板边缘溢出。板夹下层的钢板主要起支撑作用。工作时用一个泵在板 夹上加压，最大压力可达5 MPa(50 bar)，同时用另一个泵将展开剂输入到薄层板 中，以完成分离过程1。OPLC中常用的薄层板有5 cmX20 cm、10 cmX20cm以 及20 cmX20 cm等规格，不同大小的薄层板使用不同的板夹。2 工作方式OPLC 属于薄层色谱的一个分支，但由于它采用了泵输送溶剂，因此可进行 类似于高效液相色谱的在线分析，也因此有多种工作方式可供选择3。21 离线点样-分离-离线扫描这种工作方式类似于传统的薄层色谱。首先将样品

7、点于薄层色谱板上，然后 进行分离，分离后取出薄层板进行定性定量分析。在这种方法中可以同时进行多 个样品的分析，此外也可选择多种显色剂进行显色，以提高分析的专属性和灵敏 度。22 离线点样-分离-在线检测在 0PLC 仪后可以串联高效液相色谱用的紫外或其他类型的检测器，从而进 行在线检测。可将样品点于薄层色谱板上用展开剂将其连续洗脱后用检测器测定 洗脱液。23 在线进样-分离-离线扫描在展开室前可以连接高效液相色谱用手动进样器，将薄层板用展开剂充分冲 洗润湿后直接在线进样，样品分离后取出薄层板进行检测。这种工作方式每次只 能分析一个样品。24 在线进样-分离-在线检测样品经在线进样分离后也可串联

8、高效液相色谱用检测器进行在线检测。这种 方法和高效液相色谱较为相似。因此也有人将 OPLC 称为平面柱色谱。针对不同 的实验要求可以选择不同的分析方式，这是 0PLC 一个很突出的优点。3 加压薄层色谱的分离效果及其影响因素一般来说，OPLC的分离效果较传统薄层色谱好，原因主要有以下几方面。 首先，正如文章开头所提到的， OPLC 通过泵将展开剂输送至薄层板，使分析时 间缩短，待分离组分的扩散也较小。这一现象在展距增加的情况下更为明显。所 以在OPLC中可通过增加展距来达到提高分离效果的目的，也因此在0PLC中薄层 板的长度多为20 cm。此外，在传统薄层色谱中，当展开剂到达薄层板的边缘后 就

9、不能再进行分离了。但在 OPLC 中可以用泵连续输送展开剂，展开剂溢出薄层 板后分离仍可继续进行，从而提高了比移值较小组分的分离度。这些都对提高分 离效果起到了重要作用。影响0PLC分离的因素主要有以下几方面。首先，OPLC展开室中空间较小， 故气相对OPLC分离的影响较少，也有利于提高0PLC的重现性。但是在薄层板的 吸附剂颗粒的间隙中仍然存在少量气体，它们会对分离结果产生一定的影响。离 线点样与在线进样的分离结果会有一定的差别，就是因为在在线进样前已经充分 冲洗润湿了薄层板，去除了其中的气体。此外，吸附在吸附剂表面的气体也会对 分离的结果产生影响，在“42”节中专门对此进行介绍。与高效液相

10、色谱相似， OPLC 中展开剂的流速也会对分离结果产生影响。流 速过大和过小均会导致分离度降低1。在分析过程中，输液泵的压力应不大于加 压泵的压力，否则展开剂可能从板夹中溢出。在目前市售的OPLC仪中，当输液 泵压力达到加压泵压力的 80时，系统报警并自动停止工作。在板夹上所加压力的大小也会影响到分离效果。文献1表明在采用离线工 作方式时，所加压力越大，理论板高越小；但是在在线工作方式中，板夹上所加 的压力对理论板高影响不大。一般在分析过程中选择使用仪器所能提供的最大压 力。早期的OPLC仪提供的最大压力为2. 5 MPa(25 bar)，现在的0PLC仪最大可 提供5 MPa(50 bar)

11、的压力。此外，温度、所使用的展开剂以及吸附剂的粒度等也 会对分离效果有一定的影响，这些影响和传统的薄层色谱相似，不再一一讨论。4 加压薄层色谱中的常见问题及解决方法4. 1多溶剂前沿(multi-fr ont)问题在传统的薄层色谱中，如果使用多种溶剂的混合溶液作为展开剂，并且展开 前没有充分地预饱和，展开剂的不同组分就可能在薄层板上发生分离，从而出现 多个溶剂前沿。在离线工作方式的加压薄层色谱中由于减少了气相对色谱的影响 这一现象较传统薄层色谱更加严重。位于第二或其他溶剂前沿的组分通常呈窄条 状。如果同时有多个组分位于此处，则很难将其分离开。但是如果在进行制备时， 待分离组分位于第二或第三溶剂

12、前沿位置并无其他组分干扰，则只用很小体积的 展开剂就可以将该组分洗脱下来。在使用同一个展开剂时，多溶剂前沿出现的位 置是固定的，因此可以用同一个样品在距展开起始位置不同的高度多次点样，观 察这些样品点在不同位置的峰形变化来判断溶剂前沿的位置3、4。可以通过改变 溶剂的配比来调节多溶剂前沿的位置。如果仍不能满足要求，则需更换所使用溶 剂的种类。4. 2 干扰带(disturbing zone)问题3、5在离线工作方式的 0PLC 中仍有一部分气体残留。这些气体大部分存在于硅 胶颗粒的间隙中，同时还可吸附于硅胶表面。这些气体是出现干扰带的主要原因。 在展开过程中，溶剂穿过硅胶颗粒的间隙，将游离的气

13、体推出。同时，吸附剂吸 附一部分展开剂分子并释放原来吸附的气体分子。但是，当解吸附的速度比展开 剂移动速度低时，被吸附的气体就不能随着游离气体一起被推出而是释放于展开 剂中。当展开剂中溶解的气体超过其饱和浓度时，气体分子就会形成微小的气泡。 这样在已经饱和的展开剂和未饱和的展开剂之间就可以观察到干扰带。因为含有 饱和和未饱和气体的展开剂的折射率不同，因此可以清楚地用肉眼观察到薄层板 上的干扰带。从理论上说，干扰带应呈一条直线，但是由于受吸附剂粒度不均匀 的影响，在实验中所观察到的干扰带多呈锯齿状。由于干扰带是因被吸附的气体不能被快速地释放所产生，因此可以通过调节 展开剂的流动速度(即推动展开剂

14、移动的压力大小)来调节干扰带的位置。一般说 来，对于同一种吸附剂和展开剂，在干扰带出现的位置上，流速不同的展开剂所 受的压力是相同的，当展开剂的流动速度增大时，推动展开剂移动的压力也增大， 被吸附的气体就容易从薄层板上解吸，于扰带向前移动。此外还可以通过改变溶 剂种类，增加展开剂对气体的溶解度来避免干扰带的产生。如果以上两个办法均 不能去除干扰带的影响，还可在展开前用不推动样品移动的溶剂预洗薄层板。如 欲分离极性化合物时用石油醚等非极性溶剂预洗硅胶薄层板，使被吸附的气体充 分释放后再进行展开，以减少残存气体的干扰。以上问题均在离线工作方式的加压薄层色谱中存在，在在线工作方式中，因 为已经将薄层

15、板充分润洗，这些问题均不会发生。5 应用从20世纪60年代出现首台0PLC仪以来，0PLC在植物药分离制备、尿样分 析等多领域均得到了广泛的应用。下面举例简要说明其应用情况。Dallenbach-Toelke等采用普通薄层色谱、高效薄层色谱(HPTLC)、0PLC和超 微室离心薄层色谱(ultra-micro-chamber centrifugal layer chromatog-raphy, UCLC) 对药用婆婆纳 Veronica officinalis 中的环烯醚萜苷类化合物进行了分离。展开剂 均为醋酸-丁酮-氯仿-水(体积比为 25：37. 5：37. 5：7. 5)。目标化合物在普

16、通 薄层色谱中的展距为9 cm；在HPTLC中的展距为4. 5 cm；在0PLC和UCLC中的 展距均为 17 cm(OPLC 仪为 Chrompres-10(Labor MIM, Budapest, Hungary),薄层 板压力为1 MPa(10bar),输液泵压力为0. 15 MPa(1. 5 bar),先用丁酮对薄层板 进行预洗，以去除吸附剂吸附的气体，减少干扰带的影响；UCLC为该实验室自 制,采用高效薄层板进行分离)。各种薄层色谱的分离结果见图 5,可以看出,普 通薄层色谱不能将玉叶金花苷(mus-saenoside)和米内苷(minecoside)分开，HPTLC 仅能将两者刚刚

17、分开。如果在这两种薄层色谱中再增加展开距离,则均导致样品 的扩散加剧，因此作者采用FFPC对该样品进行了分离。0PLC和UcLc均可获得较 好的分离效果，其中以 OPLC 效果最好。Szikszay 等用 Automatic Personal OPLC BS-50 加压薄层色谱仪(OPLC-NIT Ltd) 对 phthaloyl-amlodipine 的纯度进行了测定。在高效薄层板上，以正己烷-醋酸丁 酯-醋酸乙酯-氯仿(体积比为60：15：15：20)为展开剂，薄层板压力5 MPa(50 bar)， 展开剂体积8 500 L，所测定的有关物质在0. 052. 00“g内线性关系良好， 测定

18、结果的相对标准偏差(RSD)为2. 9%。Mincsovics等利用0PLC对菊科植物Leuzea提取物中的葫芦巴碱(trigonelline) 进行了制备。他们将Leuzea的甲醇提取物点于OPLC硅胶薄层板上，先用展开剂 (正丙醇-甲醇-水(体积比为40：6：60)从出口向入口方向预洗薄层板，然后再从 入口到出口方向输送展开剂进行分离。预洗不仅可去除薄层板上的气泡，减少干 扰带的产生，同时还可去除样品中部分较易洗脱的植物色素，减少它们对待分离 组分的干扰。此外，他们的研究表明，0PLC很适合进行微量制备，一次可对2 5 mg的样品进行分离，得到0. 10. 5 mg的纯品。据介绍，加压薄层

19、色谱仪 还可用专门的板夹使用制备薄层板进行制备，从而使一次制备量达到几十毫克。参考文献：1 Nyiredy S. Planar Chromatography-A Retrospective View for the Third Millennium. Budapest：Springer Scientific Publisher,2001 . 1372 He Liyi . The Methods and Applications in Planar Chromatography . Bejing： chemical industryPress(何丽一.平面色谱方法及应用.北京：化学工业出版 社)

20、， 2000. 1683 Nyiredy S. Trends in Analytical chemistry， 200l， 20(2)： 914 NyiredyS， FaterZ. J Planar chromatogr Modem TLC， 1994， 7(4)： 3295 NyiredyS， MeszarosSY， Dallenbach-ToelkeK， NyiredyMikitaK， Sticher O. J High Resolut Chromatogr Chromatogr Commun， 1987， 10(6)： 3526 Dallenbach-ToelkeK， NyiredyS， SticherO. J Chromatogr， 1987. 404： 3657 Szikszay Z， Vegh Z， Ferenczl-Fodor K. J P1anar Chromatogr， 1998， 11： 4288 MincsovicsE， SardiE， VelichI， KatayG， TyihakE. JPlanarChromatogr， 2002， 15： 280