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1、实验室常用菌种的保存和管理医学病原生物学实验室主要承担微生物实验教学任务，日常 工作中经常要分离、鉴定细菌、试教演示、保存菌种等。菌种是 微生物实验的基本材料，因涉及到师生的安全，所以要正确保存， 妥善管理，逐步实现菌种的保存制度化与科学化。一、材料与方法1. 教学实验常用的菌种保存营养要求不高的菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、志贺 氏菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌。营养要求高的菌种：链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌、 脑膜炎奈瑟菌。厌氧芽孢杆菌：产气荚膜杆菌。需氧芽胞杆菌：枯草芽孢杆菌。真菌：白色念珠菌、新生隐球菌。2. 菌种的鉴定实验室中保存的菌种都要经过鉴定合格后方可使用，常用的 鉴定方法
2、有形态学观察、菌落特征、生化反应及血清学鉴定。3. 菌种的保存（1）定期传代保存法传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是 最基本的微生物保存法。传代保存时，培养基的浓度不宜过高， 营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范 围内尽量降低，培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。液 体培养基低温保存法。将保持营养要求不高的细菌接种于装有营 养肉汤的试管中，营养要求高的细菌接种于含 15%血清的营养肉 汤中，经37C。培养1814小时后，取出封口，置4C。冰箱保存。半固体穿刺保存法。将细菌穿刺接种于普通半固体培养基内， 37C培养1824小时后，在无菌条件下加入灭菌液体石
3、蜡，厚 度约1厘米，封口后置4C。冰箱保存。琼脂斜面保存法。营养 要求不高的菌种用普通琼脂斜面保存法，营养要求高的菌种用血 液琼脂斜面保存，将细菌蜿蜒接种于血液琼脂斜面上，置37C培 养1824h后，石腊封口，放于4C。冰箱保存。沙保氏培养基 保存法。该培养基用于保存真菌，将白色念珠菌、新型隐球菌接 种于沙保氏半固体培养基上，经37C培养13天后，加入灭菌 的液体石蜡，置 4C 冰箱保存。传代培养保存法操作简单、使用方便，不需要特殊设备，是 实验室菌种保存最常用的方法。但其缺点也很明显，如：保存时 间短，菌种管棉塞经常容易发霉；菌株的遗传性状容易发生变异； 反复传代时，菌株的病原性、形成生理活
4、性物质的能力以及形成 孢子的能力等均有降低；需要定期转种，工作量大；杂菌的污染 机会较多。（2）液体石蜡覆盖保存法该法较前一种方法保存菌种的时间更长，将液体石蜡灭菌， 放于37C。恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将已分纯的待存菌在 最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体，用无菌吸管吸 取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，要求液体石 蜡高出菌斜面 1cm 左右，若不够此高度，则常会引起斜面抽干 现象，将试管直立，贴上标签，置 4C 下保存，适用于霉菌、酵 母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限 制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。（3）冷冻真空干燥保存法 将待
5、存菌分纯后，用准备好的保护剂牛奶洗下菌苔，把菌悬 液滴入菌种管后，在管口抽取少许棉花塞入管内细颈处，放入冰 箱一40C。速冻40分钟，放入准备好的混有盐的冰中，接上真空 泵，真空抽干呈粉末状，火焰封口，贴上标签，保存于冰箱。此 法保存时间长，可达 15 年，不易变性，但需要专用仪器，一般 实验室难以配备，而且过程复杂，操作难度大，需要较长时间才 能完成。所以此方法适合具有条件的实验室菌种的长期保存。4. 菌种的保管安全管理制度（1）专人负责 存放菌种的冰箱加锁，保管人员定期，具备较强的责任心， 严格执行病原微生物实验室生物安全管理条例。（2）详细记录 每一种菌种都贴标签，包括名称、编号、来源、
6、接种日期、 鉴定者、保存要求及使用情况。（3）定期传代接种 按规定检查、鉴定，并接种保证菌种纯度质量。二、结果液体培养基低温可保存菌种 1年至数年；半固体穿刺可保存3 个月，琼脂斜面可保存一个月；吕氏血清斜面可保存半个月至 一个月；沙包氏培养基可保存 36 个月；冷冻真空干燥可保存 35 年。链球菌在普通培养基生长不良，可接种于血液琼脂斜面 上，每隔半个月要重新接种培养；沙包氏培养基保存真菌效果好、 时间长。实验室里保存的菌种不少对人体具有致病性，多次传代 接种易被污染和发生变异，因此工作人员操作时要规范并做好安 全防护工作，用过的接种环要立即灭菌，涂片镜检后立即消毒， 用过的器皿应放入指定容器，经高压灭菌处理。三、讨论 保存菌种的原则是根据微生物的生理、生化特性，尽量降低 微生物的代谢水平，使其基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制， 但又不至于死亡，以降低菌种的变易率。我们在做实验过程中或 者短期保存菌种时，可以选择斜面低温保存法、半固体琼脂法、 液体石蜡保存法、半固体琼脂石蜡保存法进行保存；如果需要较 长时间的保存菌株，可以选择冷冻真空干燥法保存菌株，此法需 要实验室配备好相应的仪器设备。如果一些菌株营养要求比较高 的话，当然上述菌株保存的方法不是最理想、最方便的保存法， 还需要我们不断探索，找到一种或几种简单、方便、时间长的最 佳保存方法。
实验室常用菌种的保存和管理
