《微生物发酵产酶》PPT课件.ppt

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1、酶 工 程,第二章 微生物发酵产酶,提取分离法 微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法 生物合成法 植物细胞发酵产酶 化学合成法 动物细胞发酵产酶,细胞培养方式,固体培养发酵,液体深层发酵,固定化细胞发酵,固体培养发酵 以麸皮、米糠等为主要原料，加入其它必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲，经过灭菌、冷却后，接种产酶微生物菌株，在一定条件下进行发酵，以获得所需的酶。适合霉菌的培养和发酵产酶，(原料便宜,操作简单,但传递营养物质困难,产量相对少)。 液体深层发酵 采用液体培养基，在生物反应器中，经灭菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定条件下进行发酵，生产得到所需酶。 (酶的产率高，质量稳定，产品回收率高

2、，是目前酶发酵的生产的主要方式。),固定化细胞发酵 20世纪70年代后发展的技术，把微生物固定在水不溶性的载体上，进行多批次连续或间歇发酵。这种发酵具有：细胞密度大，产酶能力高；发酵稳定性好，可反复使用或连续使用较长时间；细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率条件下连续发酵；发酵液含菌体少，利于产品分离。(额外成本高,须一定操作),第一节 产酶微生物的特点,第二节 酶发酵工艺条件及控制,第三节 固定化细胞发酵产酶,第一节 产酶微生物的特点,一、产酶细胞的基本条件,一般来说，能用于酶发酵生产的细胞必需具备的条件： 1、酶的产量高 2、容易培养和管理（生长速率高、营养要求低） 3、产酶稳定性好（

3、不易退化） 4、利于酶的分离纯化 5、安全可靠（不是致病菌）,1)凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全! 2)由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 3)非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。,二、酶发酵生产常用的微生物,1、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物之一。 枯草杆菌是芽孢杆菌属细菌。细胞成干状，大小为（0.70.8）*（23），单个，无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏染色阳性。菌落粗糙，不透明，污白色或微带黄色。 用于生产淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。例如，枯草杆菌BF7658是国

4、内用于生产淀粉酶的主要菌株；枯草杆菌AS1.398可用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。枯草杆菌生产的淀粉酶和蛋白酶都是胞外酶。而碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。,2、大肠杆菌（Escherichia coli） 形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。 Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。 应用： 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖 大肠杆菌也是最早用作基因工程

5、的宿主菌 工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸，限制性核酸 内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶， 胞内酶,3、黑曲霉（Aspergillus niger）,黑曲霉可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。如糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶、橙皮苷酶、柚苷酶等。,4、米曲霉（Aspergillus oryzae）,米曲霉可用于生产糖化酶和蛋白酶，这在我国传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。此外，米曲霉还用于生产氨基酰化酶、磷酸酯酶、核酸酶P1、果胶酶等。,5、青霉（Penicillium）,青霉菌分布广

6、泛，种类很多。其中产黄青霉（Penicillium chrysogenum）用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素V）、果胶酶、纤维素酶CX等，桔青素（Penicillium citrinum）用于生产5磷酸 二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。,6、木霉（Trichoderma）,木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉产生的纤维素酶中包含有C1酶、CX酶和纤维二糖酶等。此外，木霉中含有较强的17羟化酶，常用于甾体转化。,7、根霉（Rhizopus）,根霉用于生产糖化酶、淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素

7、酶等。根霉有强的11羟化酶，是用于甾体转化的重要菌株。,8、 毛霉（Mucor） 毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌丝体上直接生出孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针状的草酸钙结晶。 毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。,9、 链霉菌（Streptomyces）,链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16羟化酶，可用于甾体转化。,10、啤酒酵母（Sacharomycescerevisiae）,啤酒酵母主要用于酿造啤酒、酒精、饮料酒

8、和面包制造。在酶的生产方面，用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。,11、假丝酵母（Candida） 假丝酵母的细胞圆形、卵形或长形。无性繁殖为多边芽殖，形成假菌丝，可生成厚垣孢子、无节孢子、子囊孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上菌落呈乳白色或奶油色。 假丝酵母是单细胞蛋白的主要生产菌。在酶工程方面可用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶。假丝酵母具有烷类代谢的酶系，可用于石油发酵；具有较强的17羟基化酶，可用于甾体转化制造睾丸素等。,返回本节,第二节 酶发酵工艺条件及控制,一、细胞活化与扩大培养,二、培养基的配制,三、酶发酵工艺条件,四、酶生物合成的模式,一、细胞活化与

9、扩大培养,细胞活化：保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力。,扩大培养：活化了的细胞一般要经过一级至数级的扩大培养，以保证有足够数量的优质细胞用于发酵生产。,扩大培养至细胞对数期，或孢子成熟期,二、培养基的配制,培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。,1,2,3,4,5,6,注意：有些细胞生长繁殖阶段和发酵阶段所需培养基不同，要根据需要配制不同的生长培养基和发酵培养基。,1碳源,碳是构成细胞的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。所以碳源是酶的生物合成生产中不可缺少的营养物质。,在选择碳源时，必须从营养的角度和

10、碳源对酶生物合成的调节（诱导作用、分解代谢产物）方面考虑。,目前，在酶发酵生产中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如：糊精、麦芽糖、葡萄糖等。,当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用有机碳的异养型微生物。,2氮源,氮是组成细胞蛋白质和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要组成元素。,不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，一般说来，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮，微生物细胞中，异养型微生物用有机氮，自养型微生物用无机氮。,有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物。如：酪蛋白、豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、多肽、氨基酸等。无机氮源是含氮的各种无机化合物，如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、硝酸

11、钾、硝酸钠等各种铵盐和硝酸盐等。,使用时要注意C/N比值的不同,3无机盐,无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位和渗透压起调节作用。,主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。 微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。 微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但需要量很少，过量反而会引起不良效果，必须严加控制,4生长因素（酵母膏、玉米浆、麦芽糖）,是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化合物,主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动植物生长激素等。,1、pH值的调节,种子培养基和发酵培养基的pH直接影响酶的产量和质量。,发酵产酶pH与生长pH往往有所不同

12、,细胞发酵产酶的最适pH值通常接近于该酶反应的最适pH值。通过控制培养基pH可以改变各种酶之间的产量比例。,三、酶发酵工艺条件,控制pH的方法： 添加缓冲液维持一定的pH； 调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围； 调节培养基的初始pH，保持一定的C / N比； 当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。 培养基中的成分与pH变化密切相关 糖、蛋白质、氨基酸、硫酸铵、硝酸钠、尿素、磷酸盐,2、温度的调节,细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。,在细胞生长和发酵产酶过程中，由

13、于细胞的新陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温度降低，两者综合，决定了培养基的温度,温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温，故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。,3、溶解氧的调节控制,细胞的生长繁殖以及酶的生物合成过程需要大量的能量。为了满足细胞生长和发酵产酶的需要，培养基中的能源物质(一般是碳源提供)必须经有氧降解才能产生大量的ATP。为此，必须供给充足的氧气。,生长和发酵产酶的细胞，一般只能利用溶解在培养基中的氧气溶解氧。,呼吸强度大的两个阶段：,细胞生长对数期 产酶高峰期,及时通入无菌空气,

14、调节溶氧速率的方法，主要有下列几种： (1)调节通气量 (2)调节氧的分压 (3)调节气液接触时间 (4)调节气液接触面积 (5) 调节培养液粘度,(1)调节通气量,(2)调节氧的分压,通过调节空气压力或空气中氧气含量,(3)调节气液接触时间,增加液层高度、反应器中增设挡板,(4)调节气液接触面积,(5) 调节培养液粘度,使空气尽量分散（空气分配管、搅拌装置、挡板）,加入消泡剂,根据实际情况选择使用，根据耗氧速率的改变而有效快捷地调节溶氧速率。 若溶氧速率低于耗氧速率，则细胞得不到所需的供氧量，必然影响其生长和产酶； 然而溶氧速率过高，对发酵也是不利的，一则造成浪费，二则在高溶氧速率下会抑制某

15、些酶的生成，如青霉素酰化酶等；另外，为获得高溶氧速率而采用的大量通气或快速搅拌等措施会使某些细胞（如霉菌、放线菌、植物细胞和动物细胞、固定化细胞等）受到损伤。所以溶氧速率等于或稍高于耗氧速率即可。,4、 提高酶产量的措施,除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条件并根据需要和变化情况及时加以调节控制以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面活性剂或其他产酶促进剂等。,1）添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。 诱导物一般可分为3类： (1)酶的作用底物 (2)酶的反应产物 (3)酶的底物类似物(一般不随着菌生长而产

16、生浓度变化,因此效果好,但要注意其对菌的化学毒性),2）控制阻遏物浓度 阻遏作用有产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。阻遏物可以是酶催化反应产物，代谢途径的末端产物以及分解代谢物(葡萄糖等容易利用的碳源)。 控制阻遏物浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。,1).产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。,对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过 控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除（移去；少加）。 在培养基中添加抑制剂抑制尾产物形成的其它相关酶类去 阻止尾产物形成的 采用营养缺陷型突变菌株（调控基因，操纵基因突变） ,该菌种酶不再受该产物阻遏 (通常用类似结构底物培养法)

17、 。,为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度，防止分解代谢物过多而积累。,采用其他较难利用的碳源，如淀粉等,采用补料、分次流加碳源,添加一定量的环腺苷酸（cAMP）,(2)控制阻遏物的浓度,2).分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。,3）添加表面活性剂 表面活性剂可分为离子型和非离子型两大类。 由于离子型表面活性剂有些对细胞有毒害作用，特别是季胺型离子表面活性剂(如“新洁而灭”等)是消毒剂，不能用于酶的发酵生产。 非离子型表面活性剂，如tween-80，有利于酶的分泌。,4）添加

18、产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但作用机理并未阐明清楚的物质。添加产酶促进剂往往对提高酶产量有显著效果。 聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、羧甲基纤维素、苯乙醇等。,返回本节,四、酶生物合成的模式,1.迟缓期 （1）主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP等；体积增大；分裂迟缓。 （2）原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底物的酶。 （3）缩短和消除迟缓期的方法有：增加接种量、采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致。 2.对数期 （1）特点：分裂速度最快、代时最短、代谢活动旺盛、对环境变化敏感。 （2）作用：作为代谢、生理等

19、研究的好材料和发酵生产中用作种子的最佳菌龄。,3.稳定期 （1）特点：新生的细胞和死亡的细胞数目相等、总菌数达到最大值、代谢活力钝化。 （2）原因：营养物质的逐渐消耗以及代谢废物的积累抑制了生长。 （3）功能：产生次生代谢产物（抗生素、生物碱、色素等）、芽孢；对稳定期的研究发展了连续培养技术。 4.死亡期 特点：活的细胞数目以对数速率急剧下降、细胞裂解或自溶。,酶生物合成的四种类型,比较酶产生与细胞生长的关系,可把酶生物合成模式分成4种类型:,酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系， 又称为生长偶联型。,1、同步合成型（大部分组成酶，部

20、分诱导酶）,酶的生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。,同步合成型酶的生物合成可以由其诱导物诱导生成， 不受分解代谢物的阻遏作用， 不受产物的反馈阻遏作用。,当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，这表明这类酶所对应的mRNA是很不稳定的。,2、延续合成型（组成酶或诱导酶）,酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。,细胞 浓度 mg/ml,酶 浓度 U/ml,细胞 浓度 mg/ml,酶 浓度 U/ml,以半乳糖醛酸为诱导物,以含有葡萄糖的果胶为诱导物,延续合成型的酶

21、可受诱导 不受分解代谢物阻遏和产物阻遏。 在生长平衡期以后相当长所一段时间内继续用于酶的合成。因此该酶所对应的mRNA是相当稳定的，,3、中期合成型：,（1）酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成也随着停止。,酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用， 其所对应的mRNA是不稳定的。,细胞 浓度 mg/ml,酶 浓度 U/ml,4、滞后合成型（水解酶）： （1）在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。 能在细胞停止生长后，进继续利用积累的mRNA进行翻译而合成酶，因此酶所对应的mRNA稳定性高。,产生原因：

22、 由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。 若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。,酶生物合成的四种类型,（1）同步合成型： 酶的合成与细胞的生长同步进行。mRNA不稳定。 （2）延续合成型： 酶的合成伴随着细胞的生长而开始， 生长进 入平衡期后，酶又延续合成一段时间。mRNA稳定。 （3）中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进 入平衡期后，酶的合成随之停止。 mRNA不稳定，受阻遏物影响

23、。 (4) 滞后合成型 当细胞进入平衡期后，才开始并大量积累酶。 mRNA稳定，受阻遏物影响。,mRNA不稳定,稳定期不合成酶,mRNA稳定,稳定期合成酶,受阻遏物影响,酶的合成推迟,不受阻遏物影响,随细胞生长开始酶的合成,理想的酶合成模式,酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。 在酶的发酵生产中， 为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。 对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。,mRNA不稳定,稳定期不合成酶,mRN

24、A稳定,稳定期合成酶,受阻遏物影响,酶的合成推迟,不受阻遏物影响,随细胞生长开始酶的合成,同步合成型酶,提高mRNA稳定性,中期合成型酶,提高mRNA稳定性、解除阻遏,滞后合成型酶,解除阻遏,改造非理想模式,（1）选择最理想的酶合成模式延续合成型； （2）改造非理想模式 A、同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提 高相应的mRNA的稳定性； B、滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢 物阻遏，使酶合成提早开始； C、中期合成型：努力提高mRNA稳定性，解 除代谢物阻遏物。,选择与改造,第三节 固定化细胞发酵产酶,固定化细胞又称固定化活细胞或固定化增殖细胞，是指用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁

25、殖和新陈代谢的细胞。,一、固定化细胞,按固定的细胞类型分为： 微生物细胞、植物细胞和动物细胞。,按细胞的生理状态不同分为两大类 ：,死细胞：,活细胞：,完整细胞、细胞碎片、细胞器,增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞,连续使用、多酶反应,二、固定化细胞发酵产酶特性,提高产酶率（细胞密度大，反应速度快） 可以反复使用或连续使用较长时间 基因工程菌的质粒稳定，不易丢失（载体保护） 发酵稳定性好（载体保护） 缩短发酵周期，提高设备利用率（长期维持产酶特性） 产品容易分离纯化,三、固定化细胞发酵产酶工艺条件控制,1固定化细胞的预培养,采用有利于细胞生长的生长培养基和工艺条件,2溶解氧的供给,增加溶氧量,主要是

26、加大通气量,改变固定化载体,改变培养基成分,3温度的控制,4培养基成分的控制,注意连续发酵过程（预先调温度）,一般与游离细胞发酵的培养基没有多大差别，注意某些固定载体的结构会受到培养基中某些成分的影响。,返回本节,第四节 固定化微生物 原生质体发酵产酶,固定化原生质体：指固定在载体上, 在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。 原生质体进行发酵生产，可以使原来属于胞内产物的胞内酶等，分泌到细胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺直接从发酵液中得到所需的发酵产物。 原生质体易被破坏，通过凝胶包埋法可以提高其稳定性。,一、固定化原生质体的特点 变胞内产物为胞外产物 提高酶产率： 稳定性较好： 易于分离纯化：,二、发酵产酶的控制 (1)渗透压的控制： (2)防止细胞壁再生： (3)保证原生质体的浓度,