《培养基及其配制》PPT课件.ppt

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1、第三章 培养基及其配制,培养基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,第一节培养基成分及作用,主要成分包括：无机盐类（大量和微量元素）、维生素类、氨基酸类、有机附加物、植物生长调节物质、糖类，水和琼脂等。 1.大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素等。 (1)N：是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等 的组成成分，

2、在制备培养基时以NO3N和NH4N两种 形式供应。 (2)P：是磷脂的主要成分。常用的物质有KH2P04或NaH2P04 (3)K：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。 制备培养基时，常以KCI、KN03等盐类提供。 (4)Mg、S和Ca、Mg： 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H20提供。Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H2O提供。,2.微量元素：指小于0.5mmolL的元素 主要有Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。 铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等

3、的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2EDTA结合成合物使用。 B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,3.有机化合物 碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。 维

4、生素：这类化合物主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.11.0mgL。 VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,生长培养基是植物再生的必要条件,蔗糖 （0%）,蔗糖含量（ 1%）,蔗糖含量（ 5%）,外植体完全被绿色的芽所包裹，根生长在其下表面,在外植体上既没有芽发生，也没有根和愈伤组织产生,在外植体上表面边缘产生芽，也有一些根发生,芽从外

5、植体的上表面发生而根从下表面发生,tissue culture in the African Violet,(3)肌醇又叫环己六醇：在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度一般为l00mgL，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。 氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。 4.有机附加物：其对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。其成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。 常用的有机附

6、加物有: 椰乳： 香蕉： 水解酪蛋白：,5.植物生长调节物 植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。 5.1生长素类(auxin)： 在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感，在极低的浓度下，就可促进根生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内

7、酶的分解。一般生长素浓度的使用为0.055mgL。,IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。 NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。 2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影

8、响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,5.2细胞分裂素类 细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激动素)、Zt (zeatin 玉米素)等，细胞分裂素0.0510mgL。 其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6BA。 在培养基中添加细胞分裂素有三个作用： 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。 促进细胞分裂与扩大。 抑制根的分化。,5.3激素配比模式 生长素与细胞分裂素：它们的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生

9、长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。 高：有利于根的形成和愈伤组织的形成； 适中：有利于根芽的分化； 低：有利于芽的形成,生长素/细胞分裂素比例,No BAP,BAP reduced to 0.1 mg. l-1,No NAA,Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg. l-1,More balanced development of roots and shoots. Ho

10、wever, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,NAA increased to 5.0 mg. l-1 Profuse development of roots over the explant upper and lower surface,

11、and few shoots. Some callus,No MS salts No sign of regeneration from explant at all.,MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots,MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.,GA (赤霉素)： 有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应

12、等各有不同、培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。,6.抗生物质 抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%10%的抗菌素。,活性炭的应用： 茎尖初代培养，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，一般为0.1%0.2%，不能超

13、过0.2%。 活性炭在生根时有明显的促进作用，可能是通过减弱光 照保护IAA。 降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用，一般浓度为0.3%。,7.活性炭 活性炭结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用通常使用浓度为0.5l0gL。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质。,活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。 但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因

14、此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。总之，那种随意抓一撮活性炭放人培养基，会带来不良的后果。因此，在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。,、琼脂 琼脂(agar)是固体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。琼脂条的用量在610gL之间，琼脂粉的用量在34gL之间。若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。 新买来的琼脂最好先试一下它的凝

15、固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。,第二节 培养基配制及注意事项,(一) 母液配制的目的,方便配置其他培养基； 保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取,(二) 母液配制方法,（一）单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。 （二）混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液，浓度可用a mg/L表示，即配制一升培养基吸取该母液a ml.,一、培养基母液的配制,（三）母液配制的药品与器材,1、药品：配制MS培养基所需的药品、生长调节物质、蒸馏水、0.1mo

16、l/L的NaOH，0.1mol/L的HCL,2、器材：各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、 母液瓶、标签、冰箱等。,（四）母液配制（以MS培养基为例）,有机物母液,铁盐母液,无机大量 母液,无机微量母液,激素母液,配制MS培养基时母液的计算,1、无机大量母液(扩大10倍配1L ),成 分,硝酸钾硝酸铵 硫酸镁磷酸二氢钾 氯化钙,称量工具,注意：无机大量母液中的各种物质在混合过程中有些离子易产生沉淀，应使每种物质先充分溶解，再进行混合，而且钙盐最后缓慢加入进去。,硼酸，硫酸铜， 硫酸锰，硫酸锌， 氯化钴，钼酸钠， 碘化钾,托盘天平和电子天平,2、无机微量母液（扩大100倍配1000ml）,称量工具,成

17、分,3、铁盐（扩大100倍1000ml）,铁盐,硫酸亚铁， Na2-EDTA,注意：铁盐采用托盘天平称取。铁盐选用硫酸亚铁而不用硫酸铁，是因为它溶解后易产生红色的氢氧化铁沉淀。,4、有机物（扩大50倍500ml）,有机物,甘氨酸 VB1 VB6 烟酸 肌醇,注意：有机物中的物质均采用托盘天平和电子天平 称取。,5、激素母液（常用的）,生长素,NAA，IBA， 2,4-D，IAA,细胞分裂素,6-BA，KT， GA，ZT,注意：这些激素配制时，一般配成1mg/ml，NAA、IBA、IAA一般可先用少量95%酒精助溶。2，4-D可用0.1molL的NaOH或KOH助溶，细胞分裂素类一般先用少量1m

18、olL盐酸溶解。,6、母液的保存,(1) 装瓶: 将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，在标签上注明母液名称，配制倍数，与配制日期。 （2）储藏： 母液配好后放人冰箱内4低温保存，用时再按比例稀释。,二、培养基的配制,1、用具器材：粗天平、塑料量杯、烧杯、量筒、移液管、三角瓶、玻璃棒、药勺、PH试纸（5.4-9.0）、橡皮吸球、吸水纸、羊皮纸等。,2、药品试剂：蒸馏水、蔗糖、琼脂、1mol/L NaOH、 1mol/L HCL、各种培养基母液,（一）实验用品,（二）培养基配制（以1L百合继代培养基为例）,1、培养基配方：,MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂,2、配方成分计算：,3、配制步骤,混合,溶化琼脂（600-700ml）,母液的量取,加蔗糖,溶解 液,定容（1L）,调PH（5.8）,分装,1.量取前先检查母液并摇动 2.量母液前,移液管和量筒应润洗,