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1、 蛋白质层析技术导言 生物技术有三大部分：生化分离技术；DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。其中生化分离技术是生物技术的基础和支柱。层析是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。基因工程下游的核心是层析。层析技术的理论和实践已高度发展和完善。蛋白质结构组计划 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三维结构。但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。而且在这些表达的蛋白中，只有 28%的重组蛋白能够被纯化出来。最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成功的建立。蛋白质层析分离纯化机制 电荷不同：离子交换层析 大小、形状：凝胶过滤层析 疏
2、水区域：疏水层析 特异性：亲和层析（选择性是最优秀的）层析介质 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生 物大分子失活，没有生物化学毒性过强吸附、泄露。化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的。必要的机械性能：流体中的耐压性、弹性。化学组成：亲水多孔高聚物等亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析溶液中加一定浓度的盐。聚合物机体孔的结构结构：典型层析介质的放大观察孔的结构可分为三种类型整体柱（monolithic column）概念：它是由单体、引发剂、致孔剂等混合物通过原位制备而成一个棒状整体,具有制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、具有较高的柱效和可进行快速分离等优点,已在反相色谱、
3、离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了应用,并成功分离了肽、蛋白质、类固醇、芳烃、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等物质。整体柱（monolithic column）大孔结构平均孔径为2m的大孔网络，允许流动相快速通过，反压极低，从而大大降低了分离时间。中孔结构大量孔径为13nm的“中孔”，保证了目标分子在色谱分离过程中吸附/解吸附作用所需的表面积，因此，整体化色谱柱可以在高流速时保持高柱效。整体柱（monolithic column）高流速整体化色谱柱的总孔率约80，填料具有优越的渗透性，即便使用高流速进行色谱分离，柱压也很低；基本不会因脏的样品而受堵，寿命长。高柱效整体化色谱
4、柱的柱效和粒径的颗粒型色谱柱相当，而大大优于5m粒径的色谱柱。并且，整体化色谱柱在流速升高时，柱效下降程度低。整体柱（monolithic column）目前,商品化的聚合物整体柱有CIMTM,硅胶整体柱有SilicaRODTM和PrepRODsTM。默克 整体柱 ChromolithTM 蛋白质纯化平台纯化平台的硬件结构 中心设备：中压至高压层析仪 辅助设备：过滤装置，超滤装置，离心机，蛋白质电泳等蛋白质纯化平台的结构和组成 含量较高的蛋白质纯化，基本可以在三个层析步骤中实现。用目标蛋白的三个独立的物理化学性质进行层析分离。几步完成纯化？综合考虑样品的各种性质稳定性（稳定性（PH值，活性）值
5、，活性）疏水性疏水性分子大小，形状。分子大小，形状。关键辅助因子关键辅助因子 关键杂质关键杂质 产品浓度产品浓度 引进污染物引进污染物 产品纯度产品纯度 单位成本单位成本 产量产量设计合理的方案 各种机制交替试用，相互衔接、补充。（3步）分辨率：疏水层析离子交换层析 载量：疏水层析离子交换层析同样的起始样品不同的纯化方案通常纯化流程：选择性 分辨率 载量 目标蛋白为碱性蛋白，在中性附近运用阳离子交换，选择性好，除核酸多糖；目标蛋白为酸性蛋白，则第一步层析采用分子筛，最好此前将溶液脱盐，并在含.-.M NaCl的缓冲液中运行，缓冲成分视下一步而定。如果介质含聚丙烯酰胺，则应含Tris 等含氮的缓
6、冲成分，减少-互相作用造成的吸附.梯度洗脱还是分步洗脱 蛋白质层析因为保留值差别很大，比如相差1000倍，这样能够洗脱的唯一方法就是强度递增的洗脱阶段洗脱或连续梯度洗脱样品通常特点及对后续纯化的影响 大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量核酸；运行层析，则蛋白浓度不应大于10 mg/ml。(NH4)2SO4 沉淀，通常蛋白浓度1-5mg/ml.平台的操作（软件：知识结构）样品处理及准备工作 用SDS-PAGE监测整个流程 富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽量低强度的抽提方法。通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要.低渗更有利于破碎，甚至可用水进行抽提（如1：4左右）；平台的操作（软件：知识结
7、构）无特殊理由，pH应准确控制在中性附近，尽量用酸性buffer；缓冲容量：在pKa附近 缓冲容量正比于缓冲溶液的总浓度；最好运用(NH4)2SO4沉淀，缩小体积，便于保存。终止生化代谢反应，除糖、脂类。个别情形中会造成不可逆沉淀；平台的操作（软件：知识结构）经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可近似地将分子量相当2倍的蛋白质完全分开；6000个理论塔板可分开相差倍分子量的蛋白。通常，要达到3000个理论塔板的分子排阻层析柱，如用50m的介质，流速20cm/h（参照产品说明书）应在80cm以上至120cm，上样5%，一般1-2%。平台的操作（软件：知识结构）实验室规模的层析应采用不大于50
8、m的离子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则不少于 600个理论塔板。精制：高效预装柱1-5 ml，10 m左右粒度，如Mono系列等。通常条件下，采用15 m的 Resource精制也可以达到较好效果。平台的操作（软件：知识结构）表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有特殊原因不要使用超声破碎法。0C，20%蔗糖，10mM左右缓冲液，含，高渗后，加入低渗液，迅速充分悬浮。如果必要，应含DTT至2mM左右；均浆液组成原则：离子强度尽量低：50mM，有时需DTT，不一定加EDTA，可考虑加PMSF，但此时不宜用Tris等胺类缓冲剂；平台的操作（软件：知识结构）离子交换后，采用疏水层析，可省去缓冲
9、液交换步骤（Buffer Exchange）；如有必要，浓缩后，Buffer Exchange，进行精制。电导率更能反映影响离子交换的强度。离子交换：平衡液应采用尽量低的离子强度，上样体积不限；Donnan效应会造成1个pH单位的偏离，是蛋白质柱上变性的重要原因；缓冲液的离子强度越低，离子交换介质的电荷密度越大偏移越大。平台的操作（软件：知识结构）pH：阳离子通常低于pI 一个pH单位 阴离子通常高于pI 一个pH单位 Sticky protein：40%在某pH附近，与阳离子和阴离子层析介质都结合。pH 的筛选主要是考虑分离的选择性而非载量。参数获得.上样体积运行离子交换及疏水，样品不需平衡
10、。IgG样品中蛋白酶的降解作用阳离子交换与DNA污染蛋白质分子的柱上失活 分离过程可能是蛋白质失去稳定因子，如辅酶，金属离子等。吸附作用可能降低失活过程的活化能,加快蛋白的动力学过程。一般蛋白质的变性或失活过程活化能125kj/mol,高于一般化学反应的活化能，从而对温度的变化十分敏感。由上，对于易在层析过程中变性或失活的蛋白质分子，30度的温差会造成5-200倍的活性回收差别。吸附层析造成的失活 有些蛋白在柱上存留的时间长后，活性也易丧失。蛋白质层析过程中可能的氧化损伤氧化损伤的直接后果和预防 产生部位：蛋白质的金属结合部位。后果：造成蛋白质结构变化，失活，对蛋白酶更加敏感。预防：避免金属离
11、子与还原性保护剂同时存在。掩蔽和消除还原型金属离子物质是最有效 的减轻蛋白质氧化损伤的途径。（EDTA可把金属络合，但不能阻止金属离子的氧化作用）蛋白质变性因素 自然状态下，细胞中蛋白质浓度：200-400mg/ml 动物血液中蛋白质浓度：50-70mg/ml。蛋白质在生理条件和进化过程中从来没有单独的在纯化中那样的低浓度下存在过。多亚基蛋白中，亚基-亚基解离与浓度直接相关，很多蛋白质分子的不稳定，就是亚基间结合力不够强造成。表面张力，气泡，振荡，剪切和稀释都会造成蛋白质失活。动态载量 动态载量是制备层析的重要概念，也是制备层析介质的重要性指标。层析过程是偏离平衡态的，流速越大，偏离越远，反之
12、亦反。层析介质颗粒度与动态载量吸附动力学与动态载量从动态载量看上样条件吸附蛋白的大小与动态载量吸附等温线 概念：一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。停留时间流速 影响介质载量流速 影响分辨率FDA 关于蛋白质产品的重要规定FDA要求:对于用于注射用的蛋白质产品，纯度至少要达到99.99%,而且要保证产品纯度和活性的重现性;FDA要求:如果原材料中有不寻常的物质(unusualmaterial),则生产者必须建立相应的检测方法来特异的检测这个物质;FDA 关于蛋白质产品的重要规定 FDA认为:电泳的单一条带还不足以作为蛋白质纯度的证据,要结合其他
13、更灵敏的定量的方法,比如质谱;FDA规定:除了要测定蛋白质的纯度,还要考虑蛋白质的翻译后修饰及其生物学活性;FDA规定:如果有蛋白质中有必要的糖基化,那就要证明产品蛋白质中确实有这个糖基化;FDA 关于蛋白质产品的重要规定 FDA规定:一个生产程序,每次必须产出相同数量和品质的产品,否则不会被认可;FDA规定:必须进行蛋白质产品的生物活性测定,测定方法必须证明是规范和有效的,并且要确保每次生产的产品最后的活性和效用是一致的;FDA规定:产品必须有确切的可以耐受运输时间和货架时间;FDA 关于蛋白质产品的重要规定 FDA无法认可使用含有便于纯化的标签的蛋白质用于注射型药物.FDA新调整:1996年提出,可以对生产工艺做调整,只需申请相应变动部分的许可.谢谢！
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