菊苣叶中生物活性物质的提取及其抑菌活性初测

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1、菊苣叶中生物活性物质的提取及其抑菌活性初测白雪峰1作者简介：白雪峰（1982-），男，山东滕州人，硕士生，从事有害生物防治工作，E-mail：baixf1982。* 通讯作者，王厚成2，朱辉3，王延玲1，王鹏1，李国强1（1滕州市农业局，山东滕州 277500；2兰州大学资源环境学院； 3.中国热带农业科学院椰子研究所）摘要：以菊苣叶为材料，利用丙酮、乙醚、石油醚、乙醇四种有机溶剂，采用冷浸和索氏提取法分别提取叶中的活性成分。然后以提取液为供试药剂，对苹果腐烂病菌（Valsa mail）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplod

2、ieua）、构巢曲霉病菌（Aspergillus nidulans）4种植物病原真菌进行离体活性测定。结果表明：丙酮、乙醚、石油醚的提取液对4种病菌均有不同程度的抑制作用，其中对葡萄白腐病菌抑制效果最好；乙醇的提取液对枯萎病菌具有一定的抑制作用。表明菊苣叶中存在抑菌活性成分，补充了菊苣抑菌活性的研究内容，为该种植物抑菌活性成分的研究和应用奠定基础。关键词：菊苣；抑菌作用；活性筛选中图分类号：Q482.292Study on anti-microbial activity of the extracts from the leaves of Cichorium intybusBAI Xue-fe

3、ng1, WANG Hou-cheng2, ZHU Hui3,WANG Yan-ling1, WANG Peng1, LI Guo-qiang1（1Agriculture Bureau of Tengzhou, Shandong 27750, China; 2College of Eatth and Environmental Science Lanzhou University ; 3 Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences）Abstract: Active materials

4、 were extracted using acetone, aether, petroleum ether and ethanol by cold soaking and Soxhlet extraction method. The anti-microbial activity of Active materials against Valsa mail, Fusarium oxysporum, Coniothyrium diplodieua and Aspergillus nidulans were measured in vitro. The results showed that A

5、ctive materials extracted using acetone, aether and petroleum ether presented fungistasis to different extent on the four pathogenic fungi and had the best effect to Coniothyrium diplodieua. Active material extracted using ethanol presented certain anti-microbial effect to Fusarium oxysporum. The re

6、sults also showed there were anti-microbial active material in the leaves of Cichorium intybus and founded a base on the research and application.Key words: Cichorium intybus L.; fungistasis; bioactivity-screening近年来，由于化学合成农药的广泛使用，产生了严重的“3R”问题，还带来了众所周知的环境污染、生态平衡破坏和食品安全等一系列问题1，而生物农药中的植物源农药因其低毒、低残留、符合

7、现代环保和人们健康的要求而越来越引起世界各国高度重视，近几年掀起了一个研究开发植物源农药的高潮2。苏秀等发现山核桃外果皮的提取物对黄瓜炭疽、黄瓜菌核等病菌有较强的抑菌作用3。崔彦等发现五倍子、丁香、地榆的乙醇提取物对黄瓜细菌角斑病菌具较强的抑制效果4。孟昭礼等从银杏外种皮分离提纯出活性更高的化合物白果酚，仿生合成出了一种新型抑菌剂“仿生安”5，植物源抑菌剂的的研究日益成为生物农药的研究热点。菊苣（Cichorium intybus L）为菊科菊苣属多年生草本植物。在其栽培过程中极少有病虫危害，几乎不施任何农药化肥，食用安全，被称为21世纪的保健蔬菜6。近几年的研究表明,菊苣提取物不仅是菊粉、菊

8、苣酸、果糖等的重要来源，而且它本身也具有许多的生理活性，比如增强免疫能力、抗炎作用、降低胆固醇和血糖等7,8 。Ahmed B报道菊苣种子干粉甲醇提取物以及从甲醇部位分得的一酚类化合物AB-IV挥去溶剂后具有抗肝毒性的作用9，叶国华等报道菊苣在降低尿酸、甘油三酯的同时，还明显改善了血液流变学和纤溶系统活性10。对菊苣提取物的报道大部分集中在对动物和人体本身的作用11,12，在对真菌的效果上，仅徐雅酶报道过菊苣根提取物对小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌具有一定抑菌效果外13，而菊苣其它部分和其它新的靶标病菌国内外还未见报道。 本文就菊苣叶的丙酮等4种有机溶剂提取液对苹果腐烂病菌等4种植物病原真菌的抑制

9、作用进行了室内测定，初步确定了菊苣叶存在抑菌活性物质，有助于进一步对菊苣抑菌活性的认识，这将为该类活性物质的研究提供理论基础和先导资源。1材料与方法1.1 材料1.1.1供试样品供试品种为普那菊苣（Cichorium intybus L），在其生长期采集叶片自然阴干，将阴干的菊苣叶用粉碎机粉碎制成植物干粉，置于冰箱中（04）保存。1.1.2培养基与试剂真菌培养基为PDA培养基；石油醚、丙酮、乙醇、乙醚等生化试剂均为市售分析纯。1.1.3供试菌种苹果腐烂病菌（Valsa mail）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodieua

10、）、构巢曲霉病菌（Aspergillus nidulans）以上菌种均由滕州市植保站提供。1.2方法1.2.1冷浸法提取抑菌物质各称取4份50克材料，分别加入4种溶剂浸泡。每份材料均浸泡3次，每次所用溶剂量分别为200mL、200mL、100mL，提取时间分别为48、48、24h，合并滤液，最后将其浓缩至10mL，置于冰箱中（04）保存，供抑菌测定用。1.2.2索氏提取法提取抑菌物质各称取4份50克材料，分别以4种溶剂在索氏提取器中提取，之后均浓缩至10mL，置于冰箱中（04）保存，供抑菌测定用。1.2.3 室内抑菌活性测定：采用生长速率法14进行病原菌的抑菌测定。取4种有机溶剂的提取浓缩液各

11、1mL，分别与灭菌的30mL PDA培养基混合后，倒入直径为6cm培养皿内制成带毒培养基,各处理重复3次，以加等量的有机溶剂为对照。用直径为4mm的打孔器在培养好的供试菌菌落边缘切下菌饼反接于培养皿内，25培养4 d，用十字交叉法测量菌落扩展直径2次，以其平均数代表菌落的大小。抑菌率的计算公式如下： 纯生长量（cm）菌落的平均直径-菌饼的直径抑菌率（%）(对照纯生长量-处理纯生长量)/对照纯生长量100%2结果与分析对菊苣叶进行冷浸和索氏提取的样品的抑菌试验结果，分别见表1和表2。其中，待测液的浓度均为0.16g/mL（干样/毫升培养基）。通过抑菌试验，结果表明，丙酮、乙醚、石油醚、乙醇的提取

12、液对4种病菌均有不同程度的抑制作用。由表1可知，冷浸法中三种提取液对四种病菌均有一定抑制作用，其中三种提取液对葡萄白腐病菌的抑制率分别为100%、76.26%、88.00%，显著高于其它病菌。乙醇提取液的抑菌效果较差。由表2可知，在索氏提取法下，丙酮、乙醚提取液对供试病原真菌均有一定效果，其中丙酮提取液的效果较好，对苹果腐烂病菌的抑菌率最高达到76.24%，差异显著。而石油醚、乙醇提取液的抑菌效果较差。对比表1和表2可知，两种方法制备的提取液抑菌效果不同，除对葡萄白腐病菌外，利用索氏提取法制备的丙酮和乙醚的提取液的抑菌效果普遍高于冷浸法的提取液。索氏提取法采用加热的方法，可以增加提取效率，缩短

13、提取时间，同时获取较多的成分。但加热提取也能使一些不耐热的活性物质丢失，造成一些成分的丢失。因此采用两种方法，能够较全面的获取活性成分，综合两表，可以看出，对于葡萄白腐病，丙酮、乙醚、石油醚冷浸中的提取液的抑菌率均在75%以上，丙酮的索氏提取的提取液的抑菌率也超过50，冷浸法的丙酮和乙醚提取液对葡萄白腐病菌的抑菌效果显著高于其它病菌。说明菊苣叶中可能存在对葡萄白腐病菌具有高活性的抑菌物质。通过方差分析对比不同溶剂还可以看出，索氏提取的丙酮提取液对苹果腐烂病菌的抑菌效果显著高于其它病菌，说明菊苣叶中可能存在对苹果腐烂病菌具有高活性的抑菌物质。表1 菊苣叶提取物对供试病菌的活性测定（冷浸法）病原菌

14、丙酮提取液乙醚提取液石油醚提取液乙醇提取液抑菌率（%）差异显著性抑菌率（%）差异显著性抑菌率（%）差异显著性抑菌率（%）差异显著性苹果腐烂病菌9.36cC12.33bB15.42cCcC棉花枯萎病菌19.96bB 12.23bB 8.37dC 18.41aA葡萄白腐病菌100.00aA76.26aA88.00aA7.19bB构巢曲霉病菌9.60cC14.43bB39.19bBcC（为促进生长） 表2菊苣叶提取物对供试病菌的活性测定（索氏提取法）病原菌丙酮提取液乙醚提取液石油醚提取液乙醇提取液抑菌率（%）差异显著性抑菌率（%）差异显著性抑菌率（%）差异显著性抑菌率（%）差异显著性苹果腐烂病菌76

15、.24aA 26.91bAbB bB棉花枯萎病菌47.57bcB30.30aA 18.7aA 23.27aA葡萄白腐病菌54.86bB31.25aAbBbB构巢曲霉病菌32.68cB33.64aA14.22aAbB（为促进生长）3 讨论植物源农药所具有的低毒、低残留的优点，是解决我国食品安全和农产品农药残留超标等问题的可行方法。而且可开发利用的具有抑菌活性植物资源丰富，即使同一植物的根、茎、叶、花、果和种子等不同部位，其抑菌活性亦不相同15。本试验通过对菊苣叶部的提取物进行抑菌试验，发现菊苣叶中存在对葡萄白腐病菌、苹果腐烂病菌有较高抑制作用的活性物质，对今后新型抑菌剂的开发提供了理论基础。试验

16、中某些提取液对供试菌种有促进作用，分析其原因可能是提取液中的某种成分对某种病原菌有促进生长的作用。试验中两种提取方法的效果有一定的偏差，有的甚至相反，可能是植物中同时存在抑菌和促菌的活性物质8，因提取方法的不同，其抑菌和促菌活性作用不同导致的结果16。下一步对于菊苣叶的提取液中有效成分的作用方式和机制及其在活体植物上的抑菌活性，均有待进一步研究和探讨。参考文献:1刘海燕, 高微微, 樊瑛. 植物源抑菌剂的研究进展J. 中国农学通报, 2005, 21(4): 254-257, 3282顾海莎. 植物源农药研究进展综述J. 安徽农业科学, 2007, 35 (24): 7520-7521.3苏秀

17、, 马良进, 陈安良, 等. 山核桃外果皮提取物抑菌活性的初步研究J. 浙江林学院学报, 2008, 25(3): 355-358.4崔彦, 王树桐, 曹露, 等. 几种中草药提取物对黄瓜细菌性角斑病菌的抑制作用J. 中国农学通报, 2008, 24.(5): 308-312.5朱勇坤. 绿色农药仿生安在青岛诞生J. 北京农业, 2006.11.6中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志(第八十卷, 第一分册) M. 北京: 科学出版社, 1997, 6-10.7Zhang Y, Liu K, Wu L J. Advance in studies on Echinacea MoenchJ.

18、 Chin Trad Herbal Drugs, 2001, 32 (9): 8522 -8551.8Soicke H, Al-Hassan G, Gorler K. Weitere kaffeesaure-derivate aus Echinacea purpureaJ. Planta Medica, 1988, 54(2):175-176.9Ahmed B, Al-Howiriny T A, Siddiqui A B. Antihepatotoxic activity of seeds of Cichorium intybusJ. J. Ethnopharmacol. 2003, 87(2

19、-3): 237-240.10叶国华, 张冰, 萨翼, 等. 高尿酸并高甘油三酯血症鹌鹑血液流变学的变化及菊苣提取物N2对其的影响J. 北京中医药大学学报, 2004, 27(3): 37-39, 90. 11 Edelman J, Jefford T G. The mechanism of fructose metabolism in higher plants as exemplified in Helianthus tuberosusJ. New Physiologist, 1968, 67: 517-531.12Carpita N C, Kanabus J, Housley T L.

20、Linkage structure of fructans and fructan oligomers from Triticum aestivum and Festuca arundinacea leavesJ. J. Plant Physiol. 1989, 134: 162-168.13徐雅梅, 呼天明, 张存莉, 等. 菊苣根提取物的抑菌活性研究J. 西北植物学报, 2006, 26(3): 615-619.14吴文君. 植物化学保护技术导论M. 西安: 陕西科技出版社, 1998.3.15李永刚, 文景芝, 郝中娜. 植物源抑菌剂的研究现状和展望J. 东北农业大学学报, 2002, 33(2): 198-202.16韩建兴, 祝木金, 冯俊涛, 等. 27种植物抑菌活性初步筛选J. 西北农林科技大学学报, 2002, 30(6): 134-137.4