反胶束萃取课件

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1、第六节第六节 反胶束萃取反胶束萃取萃取新技术之萃取新技术之一、概述一、概述 传统的萃取法难以应用于蛋白质的传统的萃取法难以应用于蛋白质的提取分离。提取分离。分离对象的特性；分离对象的特性；萃取剂的问题。萃取剂的问题。在这一背景下发展起来了一种新的在这一背景下发展起来了一种新的萃取分离技术萃取分离技术反胶束萃取反胶束萃取。1977年，瑞士年，瑞士Luisi等人首次提出用反胶等人首次提出用反胶束萃取蛋白质；束萃取蛋白质；到到80年代，荷兰年代，荷兰Vant Riet和和Dekker、美国美国Gokelen、Hatton首先进行了反胶首先进行了反胶束萃取蛋白质的研究。束萃取蛋白质的研究。近年来该项研

2、究已在国内外深入展开。近年来该项研究已在国内外深入展开。该法的优点：该法的优点：成本低、溶剂可反复使用；成本低、溶剂可反复使用；萃取率和反萃取率都很高；萃取率和反萃取率都很高；有可能解决外源蛋白的降解问题；有可能解决外源蛋白的降解问题；构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，可直接从整细胞中提取蛋细胞的能力，可直接从整细胞中提取蛋白质和酶。白质和酶。反胶束溶液是透明的、热力学稳定的反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。系统。反胶束（反胶束（reversed micelle）是表）是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形面活性剂分散于连续有机相中一种自发形

3、成的纳米尺度的聚集体。成的纳米尺度的聚集体。二、反胶束溶液形成的条件和特性二、反胶束溶液形成的条件和特性 表面活性剂表面活性剂是由亲水憎油的极性基团是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为两性分子，可分为阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂阳离子表面活性剂和和非离子型表面活性非离子型表面活性剂剂。表面活性剂表面活性剂 有机溶剂有机溶剂 表面活性剂表面活性剂 有机溶剂有机溶剂AOT丁二丁二酸酸-2-2乙乙基己基酯基己基酯磺酸钠磺酸钠n-烃类（烃类（C6C10）、异辛烷、）、异辛烷、环己烷、四氯化碳、环己烷、四氯化碳、

4、苯苯Brij60脂肪脂肪醇酯醇酯辛烷辛烷CTAB十六十六烷基三甲烷基三甲基溴化铵基溴化铵 己醇己醇/异辛烷，己异辛烷，己醇醇/辛烷，三氯甲辛烷，三氯甲烷烷/辛烷辛烷TritonX己醇己醇/环己烷环己烷TOMAC三三辛基甲基辛基甲基氯化氨氯化氨 环己烷环己烷磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱苯、庚烷苯、庚烷表表1 常用的表面活性剂及其相应的有机溶剂常用的表面活性剂及其相应的有机溶剂 用得最多的是阴离子表面活性剂用得最多的是阴离子表面活性剂AOT（丁二酸（丁二酸-2-2乙基己基酯磺酸钠）。乙基己基酯磺酸钠）。图图1 AOT的结构式的结构式将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过CMC

5、时，表面活性剂就会在水溶液中聚集时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，称为正常胶束。在一起而形成聚集体，称为正常胶束。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过并使其浓度超过CMC，便会在有机溶剂内，便会在有机溶剂内形成聚集体，称为反胶束。形成聚集体，称为反胶束。临 界 胶 束 浓 度临 界 胶 束 浓 度(C r i t i c a l M i c e l l e Concentration)：胶束形成时所需表面：胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度。活性剂的最低浓度。表面活性剂的极性表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾头朝外，疏水的尾

6、部朝内，中间形成部朝内，中间形成非极性的非极性的“核核”。水水非极性的非极性的“核核”极性极性“头头”非极性非极性“尾尾”正常胶束正常胶束图图2-a 正常胶束的结构示意图正常胶束的结构示意图表面活性剂的极性表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾头朝内，疏水的尾部向外，中间形成部向外，中间形成极性的极性的“核核”。有机溶剂有机溶剂极性极性“头头”极性的极性的“核核”非极性非极性“尾尾”反胶束反胶束图图2-b 反胶束的结构示意图反胶束的结构示意图反胶束的制备反胶束的制备相转移法相转移法 注入法注入法 溶解法溶解法v临界浓度临界浓度 大多数为大多数为0.11.0mmol/L；v含水率含水率W W的值直接影

7、响到反胶束的大小。的值直接影响到反胶束的大小。通常反胶束通常反胶束W40，表面张力，表面张力0.2mN/m时不稳定，故反胶束最大半径时不稳定，故反胶束最大半径Rm=6nm，适用于，适用于相对分子量相对分子量pI时，反胶束萃取才可进行；而对于阴离子时，反胶束萃取才可进行；而对于阴离子表面活性剂，表面活性剂，pHpI时才可。时才可。1、水相、水相pH值值图图5 pH值对蛋白质萃取率的影响值对蛋白质萃取率的影响 对不同相对分子量的蛋白质，对不同相对分子量的蛋白质，pH值值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子量增加时，只有增大（分子量增加时，只有增大（pH-pI

8、）的绝）的绝对值，相转移才能完成。对值，相转移才能完成。eg.eg.糜蛋白酶（相对分子量为糜蛋白酶（相对分子量为2500025000）的萃取率在的萃取率在|pH-pI|pH-pI|为为2-42-4时达到最高；而牛血时达到最高；而牛血清蛋白（相对分子量为清蛋白（相对分子量为6800068000）在相同的系统中）在相同的系统中根本不发生相转移。根本不发生相转移。图图6 蛋白质相对分子量蛋白质相对分子量Mr与最佳与最佳pH和和pI值之差的关系值之差的关系（在（在TOMAC-正丁醇体系中萃取）正丁醇体系中萃取）对于包含大蛋白分子的反胶束，其尺对于包含大蛋白分子的反胶束，其尺寸远大于寸远大于“空核空核”

9、的反胶束，萃取时势必的反胶束，萃取时势必要消耗较多的能量，这些能量只能通过较要消耗较多的能量，这些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿。用调节强的静电相互作用得到补偿。用调节pH的作用来增加蛋白质分子表面电荷的方法，的作用来增加蛋白质分子表面电荷的方法，正是达到增强静电作用的一条途径。正是达到增强静电作用的一条途径。离子强度对萃取率的影响主要是由离子离子强度对萃取率的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定的：对表面电荷的屏蔽作用所决定的：离子强度增大后，反胶束表面的双电层变离子强度增大后，反胶束表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶束间的静电作用；薄，减弱了蛋白质与反胶束间的静电作用；1)

10、反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团间的斥力，使反胶束表面活性剂极性基团间的斥力，使反胶束变小；变小；2、离子强度、离子强度离子强度增大后，增大了离子向反胶束离子强度增大后，增大了离子向反胶束内内“水池水池”的迁移并取代其中蛋白质的的迁移并取代其中蛋白质的倾向；倾向；盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可改变溶解性能。可改变溶解性能。7从反胶束萃取的机理出发，选用有利于增强从反胶束萃取的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静电作用和增加反胶束大小的

11、表面活性剂。电作用和增加反胶束大小的表面活性剂。增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。从而增大对蛋白质的溶解能力。但浓度过高时，可能在溶液中形成复杂的但浓度过高时，可能在溶液中形成复杂的聚集体，增加反萃取的难度。聚集体，增加反萃取的难度。3、表面活性剂类型及浓度、表面活性剂类型及浓度 通常反胶束中表面活性剂的极性基团通常反胶束中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，有很大一部分阳离子仍不是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上，因此阳离子的种类会在胶团的内表面上，因此阳离子的种类会影响反胶束内表面的电荷密度，该密度越

12、影响反胶束内表面的电荷密度，该密度越大，产生的反胶束也越大。大，产生的反胶束也越大。4、离子种类、离子种类盐类盐类 pH值值萃取率（萃取率（%）核糖核核糖核酸酶酸酶溶菌酶溶菌酶胰蛋白胰蛋白酶酶胃乳蛋胃乳蛋白酶白酶CaCl2 1M pH5和和pH1015.7100.931.3_CaCl2 0.1M pH107.698.527.0_CaCl2 0.1M pH596.0103.059.18.4KCl 1M pH54.011.514.4_MgCl2 0.1M pH586.69.321.4_表表2 不同离子对蛋白质萃取的影响不同离子对蛋白质萃取的影响有机溶剂的种类有机溶剂的种类助表面活性剂助表面活性剂温

13、度温度5、其它因素、其它因素五、反胶束萃取蛋白质的应用五、反胶束萃取蛋白质的应用分离蛋白分离蛋白质混合物质混合物图图8 三种蛋白质混合物分离过程示意图三种蛋白质混合物分离过程示意图从发酵液中提取胞外酶从发酵液中提取胞外酶 Aries-Barros用用AOT/异辛烷体系，从异辛烷体系，从细菌发酵液中提取了细菌发酵液中提取了2 种脂肪酶；种脂肪酶；Leser 从大豆和向日葵中分离了蛋白质、从大豆和向日葵中分离了蛋白质、油脂和多酚。油脂和多酚。直接提取胞内酶直接提取胞内酶 Giovenco 利用表面活性剂可以破坏细利用表面活性剂可以破坏细胞壁的特点胞壁的特点,用反胶团体系直接提取了胞用反胶团体系直接提取了胞内酶。内酶。蛋白质复性蛋白质复性反胶团复性固态变性蛋白质示意图反胶团复性固态变性蛋白质示意图