抗生素微生物检定标准操作规程

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1、山 西 振 东 制 药起草部门：质量保证部题目：抗生素微生物检定标准操作规程第 1 页 共 22 页起草人审核人审核人审核人批准人部门/职务部 门部门负责人质量保证部生产负责人质量受权人签 名日 期版本号：00颁发部门：生效日期：分发部门：目 的：建立抗生素微生物检定标准操作规程范 围：抗生素类药依 据：中国药品检验标准操作规程2010年版 责 任：化验员 严格按操作规程操作班组长 对检验人员的操作进行监督和指导中心化验室主任 对检验人员进行培训考核，并对检验人员操作进行监督和指导内 容：1 术语或定义本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活

2、性（效价）的方法。抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。2 程序2.1 操作前准备 抗生素管碟测定法2.1.1.1 仪器与用具操作室 光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为10010000级）及空调设备，控制室温度在2025之间，达到无菌或半无菌状态。操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。注意操作，避免室内抗生素污染。双碟 内径约90mm高1617mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸碟内加

3、水23ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。陶瓦盖 内径约203mm，外径108mm，平坦，吸水性强，应定期清洗、干燥或干热灭菌。钢管 内径（6.00.1）mm，高（10.00.1）mm，外径（8.00.1）mm或（7.80.1）mm，每套钢管重量差异不超过0.05g，内外壁及两端平坦，管壁厚薄一致。每次使用后应置1:1000新洁尔灭溶液内，浸泡2h以上，灭菌后再洗涤，先用水洗涤，超声波超声30min后用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁，水冲洗，沥干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的容器内，在150160干热灭菌2h，备用。钢管放置器 有6孔和4孔两种。放置于无菌或半无菌的操作平台上，钢管下落时

4、应垂直平稳、位置正确。双碟升降平稳。应保持清洁，防止抗生素污染。可定期用75%乙醇棉擦拭落管筒及储管杯。置钢管的玻璃管应定期干烤灭菌。恒温培养箱 以隔水式为宜，温度平稳，波动小。除另有规定外，依各品种项下要求设定温度，温度波动范围为3537或2426，箱内网状隔板上放置带孔的玻璃板并调节至水平。灭菌刻度吸管 用于吸取菌液及培养基。用后应立即置5%石炭酸或1:1000新洁尔灭溶液中消毒后，再按玻璃容器的常规洗涤法洗涤。洗涤沥干后在吸口处塞入脱脂棉（松动、透气），置适宜容器中，在120以上干热灭菌2h或121蒸气灭菌30min，烘干备用。玻璃容器 包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均应符合“常用

5、玻璃量器国家计量检定规程”的规定。每次使用前用清洁液浸泡，水冲洗，并用蒸馏水或去离子水冲洗3次，沥干。称量瓶 重量在10g以下。用毕先用水冲洗，沥干，置清洁液浸泡2h以上，然后分别用水、蒸馏水或去离子水冲洗3次，置洁净平皿中，在120干热灭菌3h，待冷置6070时，取出置于干燥器中备用。滴管 用玻璃管拉制，管口平滑。使用前在清洁液浸泡，分别用水、蒸馏水或去离子水冲洗3次，置适宜容器中，在120干热灭菌3h后，备用。天平 分析天平，精密度0.1mg，经计量检定。抑菌圈直径（面积）测量仪 应符合“抑菌圈测量仪检定规程”的规定。游标卡尺 精度0.02mm，长度150mm。超净工作台 有效工作面局部洁

6、净度100级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备。超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。2.1.1.2 试液灭菌缓冲液 制备缓冲液的试剂应为分析纯，制备后的缓冲液应澄明，分装于玻璃容器内，经121蒸汽灭菌30min备用。磷酸盐缓冲液（pH5.6） 取磷酸二氢钾9.07g，加水使成1000ml，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至5.6，滤过，在115灭菌30分钟。磷酸盐缓冲液（pH6.0） 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过。磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过。磷酸盐缓冲液（pH7.8） 取磷酸氢二钾5.

7、59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过。磷酸盐缓冲液（pH10.5） 取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钾溶液2ml，加水使成1000ml，滤过。2.1.1.3 培养基 配制培养基的各成分原料质量对抑菌圈边缘清晰度及试验结果影响较大，因此应对原材料进行预试验，挑选适当的品牌使用。 制成的培养基不应有沉淀，如产生沉淀，可在配制培养基后，于115加热20min融化，趁热用纸浆减压或适宜方法过滤，调节pH，分装灭菌备用。中国药典2010年版二部附录的抗生素微生物检定法中收载了13种不同处方的培养基及制备方法。目前，已有市售干燥培养基，使用方便。临用时，按照使用说明进行配制，

8、但应注意核对培养基的pH，必要时需调节pH，使其符合规定。另外，市售干燥培养基的质量也存在差异注意选择合适的产品。2.1.1.4 菌种的复苏 检定用标准菌种为冷冻干燥品，由中国药品生物制品检定所提供。取冻干菌管、灭菌1ml毛细滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面，移入接种室操作台或超净工作台、将冻干菌种管外壁用碘酒（碘伏）擦拭消毒，稍干，用75%乙醇棉球擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌毛细管吸取营养肉汤培养基，滴在上述灼热的菌种管封口端，使其骤冷炸裂。取灭菌镊子，在酒精灯火焰上方，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取一支灭菌毛细滴管

9、，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加置菌种管底部，将冻干菌块搅动使其溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将毛细滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置3537培养2224h。取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌，涂片并进行格兰染色镜检，如呈典型菌落，则转种3代即可使用。菌落不典型时，可进行平板分离单菌落。.5 菌种的接种与保存 准备需用的培养基 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。在标签上注明菌名及接种日期。从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30min，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。点燃酒精灯或煤气灯等，左手握住菌种斜面，将

10、管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却在移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰上方。塞上管塞，左手见菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面底部，由底向上，接种环轻帖斜面的表面曲折蛇形移动，使细菌接种在斜面的表面上。取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。将已接种的细菌管置3537培养2224

11、h，霉菌管一般置2425培养2425h霉菌培养箱内培养7天。培养后放入4冷藏箱内保存，一般13个月转种一次。.6 菌悬液的制备枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CMCC(B)63 501悬液 取枯草芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，加灭菌水12ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬浮液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀分布，在3537培养7日。取菌苔少许涂片，革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水10ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在65水浴中加热30分钟将菌体杀死，待冷却后置4冷藏箱储藏。此菌液为浓菌液。日常试验用菌液 取上述浓菌液，用灭

12、菌水1：3稀释至灭菌试管中，冷藏箱保存备用。短小芽孢杆菌Paullus pumilus CMCC(B)63 202悬液 取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备芽孢悬液。金黄色葡萄球菌Staphylocouuc aureus CMCC(B)26 003悬液 取金黄色葡萄球菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营养琼脂斜面上，在3537培养2022小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，制成悬液。置4冷藏箱保存，可使用3天。藤黄微球菌 Micrococcus luteus CMCC(B)28 001悬液 取藤黄微球菌工作用菌营养琼脂斜面培养物，用1ml培养基将菌苔洗

13、下，用吸管移至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶中，均匀摊布，将培养瓶倒置于培养箱中2627培养24小时取出，用吸管吸取培养基或9%的灭菌氯化钠溶液5ml至培养瓶中，将菌苔洗下，合并菌液至灭菌大试管中备用。置4冰箱保存，可使用12个月。大肠杆菌Eschehchia coli CMCC(B)44 103悬液 取大肠杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。肺炎克雷伯菌Klebosiella Pneumoniae CMCC(B)46 117悬液 取肺炎克雷伯菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。啤酒酵母菌S

14、accharomyces cerevisiaeATCC 9763悬液 取啤酒酵母菌的V号培养基琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种于培养基斜面上，在3235培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下，放置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，以当日使用为宜。试验菌的菌龄对抑菌圈边缘清晰度有一定影响，应保持菌种新鲜。对易变异的菌株如藤黄微球菌等，宜在制备菌悬液前进行单菌落的分离，选择典型菌落以保持菌悬液中菌群的一致性，以使所得的抑菌圈边缘清晰、整齐。 抗生素微生物比浊法.1 环境、仪器与用具操作室 要求同管碟法仪器 可采用自动浊度法测定仪或分光光度计。自动浊度测定仪 主要由光源、样品室、检测器、记录仪、显示

15、系统和数据处理系统等部分组成。环境条件 防止强光照射，仪器应平稳放置在工作台上，便于操作，周围无强烈的机械运动和电磁干扰。仪器使用前，应预先稳定23h后，再进行测量。吸收池 应使用容量在15ml左右的石英吸收池。当吸收池中装入蒸馏水，在530nm、580nm、650nm 波长处测定各吸收池的吸光度，差异应不大于0.005。温度准确度 实测温度与设定温度差异应在0.1内。实测温度与设定温度30min内漂移偏差应在0.1内。测定样品室4个不同位置处的温度，差异应在0.1内。波长准确度的允差范围在530nm、580nm、650nm波长处，允许误差在2.0nm。搅拌控制 各吸收池应配有转子搅拌装置，搅

16、拌部分应正常运转，搅拌速度均匀。浊度测定仪 根据其结构和测量方式，其光源分为单通道光源和多通道光源两类。对于多通道光源，在530nm、580nm、650nm波长处测定国家计量认可的滤光片的吸光度，不同通道光源间的差异应不大于0.003。重复性 在530nm、580nm、650nm波长处测定的滤光片的吸光度，连续测定5次，差异应不大于0.005。在530nm、580nm、650nm波长处测定滤光片的吸光度，4 h内吸光度的差异应不大于0.003。吸收池应采用随机区组或其它统计学方法排列放置，以消除支间测定差异的影响。样品测定时，应放置1个阴性管和一个阳性管。测定仪的吸光度测定带有自动扣除阴性空白

17、的功能。实验报告除出具标准品和供试品的吸光度和统计计算结果外，还应提供阳性菌的生长曲线，各管的培养终止时间应处于实验菌的对数生长期内。根据阳性菌的生长曲线，如阳性菌生长不佳，则实验不成立，应重新实验。分光光度计 应有数字显示功能和自动记录装置，数显精度应在小数点后三位。其各项指标应符合紫外可见分光光度计的检定规程。玻璃大试管 20.5mm2.5mm或适宜的试管，应大小一致，厚薄均匀，玻璃质地相同，使用同一品牌和批号。使用过的试管经灭菌后，将培养基倾出，用水清洗，沥干，再用硫酸一重铬酸钾洗液浸泡，清水冲洗干净后，晾干，在160干烤23 h灭菌，保持洁净，备用。注意避免污染毛点、纤维等，以免干扰测

18、定结果。移液管 10ml或20ml刻度容量，管口需磨粗（大），以便快速分装培养基。恒温水浴箱 工作体积600 mm300mm150mm（长宽高），电热恒温水浴。电动搅拌器 将二台电动搅拌器的浆叶置于恒温水浴的大试管随机区组培养方列的两侧，于水中搅动，以使水温均匀。本身带搅拌或循环水系统的恒温水浴箱，可不再配备电动搅拌器。分光光度计用吸收池 方形玻璃吸收池或石英吸收池，用硝酸一硫酸混合液（取浓硫酸95ml，加浓硝酸35 ml，混匀）浸泡148h（浸泡时间视是否能去除附着污物而定），先后用水、去离子水（蒸馏水）冲洗干净，晾干，备用。如仍不能除去附着污物，可用1%2%硝酸钠的浓硫酸溶液浸泡后，再经水

19、洗涤。其他 分析天平、称量瓶、量瓶、25 ml 及50 ml 滴定管、定量吸管或刻度吸管、秒表、滤纸及镜头纸等。.2 试液 除同管碟法的要求外，比浊法用的缓冲液应澄清无色。缓冲液配制后用垂熔玻璃漏斗滤过，除去沉淀等不溶物，使溶液澄清。使用前灭菌。.3 培养基 除同管碟法的要求外，比浊法使用的培养基应澄明，颜色以尽量浅为佳，培养后培养基本身不得出现浑浊。培养基经灭菌后不得发生沉淀。根据这一原则，通过对培养基原材料的预试，挑选合适品牌厂家的产品使用。目前，已有一些种类的市售干燥培养基，如营养琼脂培养基、改良马丁培养基等，使用方便。.4 试验用菌液 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus au

20、reus）悬液 取金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面培养基上，在3537培养2022h。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。大肠杆菌（Escherichia coli）悬液 取大肠杆菌CMCC(B)44 103的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面培养基上，在3537培养2022h。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。白色念珠菌（Candida albicans）悬液 取白色念珠菌CMCC(F)98 001的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种于10ml培养基中，在3537培养8h，再用培养基稀释至适宜浓度，备用。2.2 操作方

21、法 抗生素管碟测定法2.2.1.1 称量称量前先将标准品从冰箱中取出，使其温度与室温平衡。供试品与标准品称量应使用同一架天平；对于吸湿性较强的抗生素，应在称量前12h更换天平内干燥剂。标准品与供试品的称量尽量一次取样称取，不得将以取出的称量物倒回原容器内。标准品的称取量不得少于20mg，取样后立即将盛有样品的称量瓶或适宜的容器用盖盖好，以免吸水。 称量样计算：W=VCP式中 W为需称量标准品或供试品的重量（mg）；V为溶解标准品或供试品制成浓溶液时所用容量瓶的体积（ml）；C为标准品或供试品浓溶液的浓度（u/ml或g/ml）；P为标准品的纯度或供试品的估计效价（u/ml或g/ml）；.2 稀释

22、 稀释操作应遵照容量分析操作规程进行。用于溶解及稀释标准品或供试品的容量瓶和移液管等玻璃量器，应按“常用玻璃量器国家计量检定规程”进行标定，符合A级要求。每步稀释，量取量不得少于2ml，稀释步骤一步不超过3步。举例：量取贮备液（1000/ml）,进行以下稀释。第一步 精密量取5ml（1000/ml） 50ml量瓶，稀释至刻度 100/ml第二步 精密量取5ml（100/ml） 50ml量瓶，稀释至刻度 10/ml（H）精密量取5ml（100/ml） 100ml量瓶，稀释至刻度 5/ml（L）量取供试液尽量使用刻度移液管，正式量取前用供试液流洗23次，吸取供试液溶液后，用滤纸将外币多余液体拭去，

23、从起始刻度开始放溶液。标准品溶液和供试品溶液应使用统一缓冲液（溶剂）稀释，以避免应pH或浓度不同而影响测定结果。稀释时，每次加液至接近量瓶刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。二剂量（2.2）法的标准品溶液及供试品溶液高、低浓度之比为2：1或4：1。三剂量（3.3）法的标准品溶液及供试品溶液高、中、低浓度之比为1：0.8。但所选用的浓度必须在剂量反应直线范围内。.3 双碟制备双碟的制备应在半无菌室或洁净室内进行，并注意避免微生物及抗生素的污染。培养基应在水浴中或微波炉内融化，避免火加热。底层 用灭菌大口20ml吸管或其它灭菌分装器，吸取已融化的培养基20ml注入双碟内，待

24、凝固后更换干燥的陶瓦盖，放置于3537培养箱中保温，使菌层易于摊布。菌层 取出试验用菌悬液，按预试好的加菌量（2.2）法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在1822mm，（3.3）法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在1518mm，用灭菌吸管吸取菌悬液适量，加入已融化并保温在水浴中（水浴温度，细菌为4850，芽孢可至60）的培养基内，摇匀，作为菌层培养基用。取出加有底层培养基的双碟，用灭菌大口5ml、10ml吸管或其它适宜分装器，吸取菌层培养基5ml，加于底层培养基上，使其均匀摊布，用干燥陶瓦盖覆盖，放置2030min，待凝固。放置钢管 用钢管放置器，将灭菌的钢管放入贮管筒（杯）内，按说明书

25、要求操作，使钢管平稳的落在培养基上，注意使钢管下落的高度基本一致。如无钢管放置器，可用小眼科镊子夹持钢管，轻轻的放置在培养基上，相应剂量的钢管对角均匀放置。钢管放妥后，应使双碟静置510min，钢管在琼脂上沉稳后，再开始滴加抗生素溶液。2.2.1.4 滴加抗生素溶液每批供试品取不少于6个双碟，滴加溶液用灭菌毛细滴管或微量加样器（调节加样量约为200300l）在滴加之前需用溶液洗23次。滴加标准品及供试品溶液顺序，应实验设计方法不同而异。（2.2）法，在双碟的4个钢管中分别成“Z”字行滴加标准品（S）及供试品（T）高（H）、低（L）两种浓度溶液，即滴加溶液的顺序为SHTHTLSL；（3.3）法的

26、6个钢管中间隔3个钢管中分别滴加标准品及供试品高（H）、中（M）、低（L）3种浓度溶液，并使相同浓度成对角，滴加顺序为SHTHSMTMSLTL。滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液的间隔不可过长，否则因钢管内溶液的扩散时间不同会影响测定结果。每份滴加的溶液为同一单位，但双碟数每次不超过5个，如1份溶液滴加双碟数码多，可分次滴加。每种溶液各用1支毛细滴管。滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳至于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3层，以免受热不均，影响抑菌圈大小。将双碟托盘水平平稳地移入培养箱中间位置，在3537或该药品标准规定的温度下培养至所需时间。2.2.1.5 抑菌圈测量将培养好的双碟取出，拿掉陶瓦盖

27、，将钢管倒入盛有1：1000新洁尔灭（苯扎溴铵）溶液或其它消毒液内灭菌，换以玻璃盖；测量抑菌圈前，应检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或圈不完整，应舍弃该碟，切忌主观挑选双碟或抑菌圈，以免造成测定结果的偏倚。测量抑菌圈可以使用抑菌圈测量仪，也可用游标卡尺；使用的抑菌圈测量仪应经过检定，并符合检定规程要求，操作时应按仪器的操作规程进行；使用游标卡尺测量时，眼睛视线应与读数刻度垂直，用卡尺的尖端与抑菌圈直径的切点成垂直方向测量。2.2.1.6 记录与计算记录 试验记录应包括抗生素药品名称、规格、批号、生产厂家、检品编号、检验依据、检验日期、温度、相对湿度、标准品名称、标准品批号、标准品来源及标准品标示含

28、量、试验菌名称，及菌悬液浓度、培养基名称、来源及批号，缓冲液名称及pH、供试品估计效价、抑菌圈测量仪型号及编号、标准品与供试品的称量、稀释步骤、试验人与校核人，抑菌圈测量及数据处理结果。当用游标卡尺测量抑菌圈直径时，应将测得数据按相应剂量浓度以列表形式记录。用测量仪测量抑菌圈面积或直径时，应将仪器的测量、数据处理、统计分析及计算结果打印后粘附于记录页面上。计算 二计量法（2.2）效价计算公式 P=log -1T2+T1-S2-S1IX100%T2+S2-T1-S1式中 P为供试品效价（相当于标示量或估计效价的百分数）； S2为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和； S1为标准品低浓度

29、溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和； T2为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和；T1为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和；I为高、低浓度剂量之比的对数值，2:1时。I=0.301。4:1时，I=0.602。举例 乳糖酸红霉素效价测定及计结果抑菌圈面积测量结果碟数抑菌圈面积S2S1T2T1115711276158112682148111991523117331523130214971263415181214153312265157312371543126861546121915801224714951260152612408153012371548126391605125

30、61593129310164912721608132015491124721553212528估计效价（AT）=603u/mg剂距（I）=0.301P=log-115532+12528-15491-124720.301100%=101.1%15491+15532-12472-12528效价（PT）=PAT=101.1%603u/mg=609.8u/mg三剂量法（3.3法）效价计算公式P=log-10.1292(T3+T2+T1-S3-S2-S1)100%S3+T3-S1-T1式中 S3为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和； S2为标准品中间浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和；S

31、1为标准品低浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和；T3为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和；T2为供试品中浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和；T1为标准品低浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和；I为高、低浓度剂量之比的对数值，1：0.8时，I=0.0969。举例 新霉素效价测定及计算结果。抑菌圈直径测量结果碟数抑菌圈直径S1S2S3T1T2T3116.0516.2016.5015.8016.3516.60216.2016.4516.6516.2016.4516.70316.0016.4516.7016.0516.3516.70415.9516.3516.6016.0016.

32、2516.60515.7016.2516.6015.8516.2516.60615.5516.2016.5515.7016.2016.60715.6516.2016.4015.8016.1516.40815.9016.1016.4515.8016.1016.50915.6016.0016.3015.7015.9516.30142.60146.20148.75142.90146.05149.00估计效价（AT）=670u/mg剂距（I）=0.0969P=log-10.1292(142.90+146.05+149.00-142.60-146.20-148.75)100%=101.1%效价(PT)=

33、 PXAT=101.1%670U/mg=676.7 U/mg.7 结果判定可靠性测验 管碟法系根据量反应平行线原理而设计，并要求在试验所用的剂量（浓度）范围内，对数剂量（浓度）与反应呈直线关系。可靠性测验即通过对剂间变异的分析，以测验标准品和供试品的对数剂量与反应的关系是否显著偏离平行直线。(2.2)法的剂间变异分析为试品间、回归和偏离平行三项；（3.3）法还需要再分析二次曲线和反向二次曲线。如用游标卡尺测量抑菌圈直径可用（2.2）法和（3.3）法的专用数据处理软件对测量数据进行统计学处理和结果计算。用抑菌圈测量仪测量抑菌圈时，测量与统计学处理一次完成，统计学分析按药典附录的生物检定统计法进行

34、F的显著性测验。（2.2）法要求直线回归和剂间要非常显著（P0.01）,偏离平行应不显著（P0.05）；（3.3）法除（2.2）法的上述规定外，尚需考察二次曲线和反向二次曲线，且二者均应不显著（P0.05），符合以上各项规定后，才能认为试验结果可靠，方可进行效价和可信限率计算。可信限率 考核试验的精密度，除药典各论另有规定外，管碟法的可信限率不得超过5%。上述各项都能符合者，试验结果成立。试验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。原料药效价测定一般需做双份样品平行试验，以便核对。对于检验结果不符合规定的样品，应由可靠性测

35、验及可信限率均符合规定，且测定结果在估计效价（原料药）或标示量（制剂）10%范围内的至少两个效价测定结果，必要时应请其他检验人员复核，才能发出检验报告。效价测定结果的有效数字按中国药典规定及数字修约的原则取舍。 抗生素微生物比浊法.1 称量 要求同管碟法.2 稀释 标准品与供试品溶液的稀释应使用经标定的量瓶，每步稀释的量取量以不少于2ml为宜，稀释步骤一般不超过3步。.3 标准曲线法标准品溶液 按中国药典该品种含量测定项下的要求，制成一定浓度的标准品贮备液。在该品种项下规定的剂量反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度，标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜（通常为1：1.25）

36、。供试品溶液 根据估计效价或标示量，取供试品按标准品溶液的制备方法，选择中间浓度，不少于3个试管。含试验菌液体培养基的制备 临用前，取规定的试验菌悬液适量（3537培养34h后测定的吸光度在0.30.7之间），加入到各液体培养基管中，混合均匀，使在试验条件下能得到满意的剂量反应关系和适宜的测定浊度（吸光度）。含试验菌液体培养基在配制后应立即使用，必要时可适当冷却，以防止试验菌在培养前生长。线性试验 取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各个试管内分别精密加入各个浓度的标准品和供试品溶液各1.0 ml，再精密加入含试验菌的液体培养基9.0 ml，立即混匀，按随机区组分配将各个试验管放置于恒温水浴内

37、，在规定的条件下培养（通常约4 h）至适宜测量的浊度值（吸光度值）。各浓度不少于4个试管。.4 平行线测定法二剂量(2.2)和三剂量（3.3）法标准品溶液 按中国药典该品种含量测定项下的要求，制成一定浓度的标准品贮备液。在该品种项下规定的剂量反应线性范围内，选择2个或3个剂量，剂量间的比例应适宜（二剂量通常为2:1或4:1，三剂量通常为1:0.8）。供试品溶液 根据估计效价或标示量，取供试品按标准品溶液的制备方法，选择2个或3个剂量。含试验菌液体培养基的制备 同含试验菌液体培养基的制备方法标准品及供试品测定 取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各个试管内分别精密加入2个或3个浓度的标准品和供试

38、品溶液各1.0 ml，再精密加入含试验菌的液体培养基9.0 ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4h），各浓度不少于4个试管。.5 空白试验 另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0 ml，其中在一支试管中立即加入12%甲醛溶液0.5 ml，混匀，作为空白对照，另一支试管同法培养作为试验菌生长对照。.6 吸光度的测量 在线测定各试管的吸光度或浊度，或取出试管立即加入12%甲醛溶液0.5 ml以终止微生物的生长，在530nm或580nm波长处测定各管的吸光度或浊度。.7 培养时间 观察试验菌的生长曲线，测定时间应处在

39、试验菌的对数生长期内，且测定的吸光度应在0.30.7之间。另外，还可考虑吸光度一供试品浓度（对数值）的反应曲线，如较平坦，可考察选择不同的培养时间，如反应曲线斜率增加，则可增高试验的灵敏度。一般培养时间为34h。测定效价时，选择一个培养时间点的吸光度即可。.8 标准曲线法记录与计算试验记录要求与管碟法相同。效价计算 按下式计算的标准曲线的斜率b和截距a，从而得到相应的标准曲线线性方程。 斜率（b）=（x- x）（y- y）（x- x）2截距（a）= y - b x标准曲线线性方程Y=bX+a式中 x为抗生素标准品溶液的浓度或浓度的数学转换值； x 为抗生素标准品溶液的浓度或浓度的数学转换值的平

40、均值； y 为各标准品溶液的吸光度或浊度； y 为标准品溶液的吸光度或浊度的平均值。计算各浓度试管供试品溶液吸光度或浊度的平均值，自标准曲线上或按标准曲线的线性方程，求得抗生素的量，再乘以供试品溶液的稀释度，即得供试品中抗生素的效价含量。回归系数的显著性测验 判断回归得到的方程是否成立，即X、Y是否存在着回归关系，可采用t检验。X、Y应具有直线回归关系。计算方法如下：假设H0：b=0，在假设H0成立的条件下，按公式计算t值。 估计标准差：SY，X=（yi-Y）2/（n-2）1/2 回归系数标准误差：Sb=SY，X/（xi- x）2 1/2 t=（b-0）/Sb式中 yi为标准品的实际吸光度；

41、Y为估计吸光度或浊度（由标准曲线的直线回归方程计算得到）； y 为标准品的实际吸光度或浊度的均值； xi为抗生素标准品实际浓度lg值； x 为抗生素标准品实际浓度lg值的均值。对于相应自由度（2n-4）给定的显著性水平（通常=0.05），查表得t/2(n-2)，若 tt/2(n-2)，则拒绝H0，认为回归效果显著，即X、Y具有直线回归关系；认为回归效果不显著，即X、Y不应具有直线回归关系。可信限率 测验试验的精密度，除药典各论令有规定外，本法的可信限率不得超过5%。按下试计算得到的抗生素浓度lg值在95%置信水平（=0.05）的可信限及可信限率。X0的可信限：FL=X0t/2（n-2）（SY，

42、X/b）1/m+1/n+（X0- x）2/xi2- xxi1/2式中 n为标准品的浓度数乘以平行测定数； m为供试品的平行测定数； X0为根据线性方程计算得到的抗生素的浓度lg值； Y0为抗生素样品吸光度的均值。可信限率FL=（X0高限-X0低限）/2X0100上述各项规定都能符合者，试验结果成立。.9 平行线测定法记录与计算效价计算二剂量(2.2)法效价计算公式P=log-1T2+T1-S2-S1)I100%T2+S2-T1-S1式中 P为供试品效价（相当于标志量或估计效价的百分数）； S2为标准品高浓度溶液所致吸光度或浊度的总和； S1为标准品低浓度溶液所致吸光度或浊度的总和； T2为供试

43、品高浓度溶液所致吸光度或浊度的总和； T1为供准品低浓度溶液所致吸光度或浊度的总和；I为高、低浓度剂量之比的对数值，2：1时，I=0.301；4：1时，I=0.602。三剂量法效价计算公式P=log-10.1292(T3+T2+T1-S3-S2-S1)100%S3+T3-S1-T1式中 S3为标准品高浓度溶液所致吸光度的总和； S2为标准品中间浓度溶液所致吸光度或浊度的总和； S1为标准品低浓度溶液所致吸光度或浊度的总和； T3为供试品高浓度溶液所致吸光度或浊度的总和; T2为供试品中间浓度溶液所致吸光度或浊度的总和； T1为供试品低浓度溶液所致吸光度或浊度的总和；I为高、低浓度剂量之比的对数

44、值，1：0.8时，I=0.0969。可靠性测验 计算方法及要求同管碟法二剂量（2.2）和三剂量（3.3）法。即（2.2）法，回归、剂间P0.01，偏离平行P0.05。（3.3）法，除符合（2.2）法的要求外，二次曲线、反向二次曲线P0.05。可信限率 其可信限率除另有规定外，应不大于5%。实验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。原料药效价测定一般需做双份样品平行试验，以便核对。对于检验结果不符合规定的样品，应有可靠性测验及可信限率均符合规定，且测定结果在估计效价（原料药）或标示量（制剂）+10%范围内的至少两个效价测定

45、结果，必要时应请其他检验人员复核，才能发出检验报告。效价测定结果的有效数字按中国药典规定及数字修约的原则取舍。3 注意事项3.1 抗生素原料药 不含辅料的药物制剂原料，一般其效价以纯度（U/mg或g、mg）表示。检验时，可参考该品种的药品标准纯度限度规定或厂方提供的纯度估计效价，取样试验，如估计效价与实际效价相差较远时，即测定所得效价超出估计效价的10%时，则重新估计效价，再做准确测定。原料药一般皆以干燥品或无水物折算效价，需先测其含水或未折干效价，再根据供试品的水分或干燥失重测定结果折算成无水物或干燥品的效价。 干燥品或无水物效价（U/mg）=湿品（或未这干品）效价（U/mg）1供试品干燥失

46、重或水分%3.2 抗生素制剂3.2.1粉针剂 指注射用无菌粉末或冻干品，用西林瓶橡胶塞铝盖封装或熔封在安瓿内，一般测定其纯度（U/mg或g/mg）或整瓶效价。取装量差异项下的内容物，称取适量（50 mg以上，根据标示量及平均装量折算估计效价，并按估计效价及量瓶体积计算取样量），置量瓶中，加标准中规定的溶剂溶解，稀释，测定，计算取1 mg的效价单位数，再根据平均装量及标示量计算平均每瓶的百分含量。 水针剂（注射液） 即抗生素的灭菌水溶液，标示量一般按每毫升含效价单位计。效价测定时，量取平均装量项下的内容物或510支的内容物，混匀，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供试品，将吸管外壁用滤纸拭净，再弃去多

47、余的溶液，使供试品至吸管刻度，沿量瓶颈部内壁缓缓流放入已盛有一定量溶剂（以免抗生素结晶析出）的量瓶内，混匀，继续加溶剂至刻度，摇匀，再量取适量稀释至规定的浓度。 片剂 包括素片、薄膜衣片、糖衣片及肠溶片。素片、薄膜衣片 称取20片的总量，求出平均片重，研细混匀后，精密称取适量（约相当于1片的重量或根据标示量按平均片重及所用量瓶体积折算取样量），置量瓶中，用标准中规定的溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀。再量取适量稀释至规定浓度。注意点：研磨时应注意环境干燥，可在干燥操作柜内操作，研磨要迅速，避免吸湿，因片剂内含辅料较多，辅料可能漂浮于溶液表面，稀释时量取供试溶液应该读取辅料下层的溶液切面；如沉淀较多

48、，须待其下沉后再量取上层液；有些辅料吸附抗生素，应加以注意。为节约供试品，可与重量差异检查结合进行。糖衣片、肠溶片 取标准中规定的片数，置于乳钵中，研细，分次加入规定的溶剂，研磨使其溶解，将研磨液转移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶体积根据供试品的标示量、所取片数及抗生素储备液浓度（一般为1000U/ml）选定，用规定溶剂稀释至刻度，摇匀，静置，使辅料下沉而抗生素已溶解在溶液内，精密吸取量瓶中的上层液适量，作进一步稀释。个别品种标准如同时收载了糖衣片和薄膜衣片，可能规定薄膜衣片也取整片制备供试溶液。 胶囊剂 取装量差异项下的内容物，混合均匀，研细，根据平均装量，精密称取约相当于1粒胶囊的量或按标

49、示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，如供试品含有较多的辅料，则照片剂项下的方法进行。 颗粒剂、干混悬剂 取装量差异项下的内容物，混匀，根据平均装量，精密称取约相当于1袋（包）的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。量取适量稀释制成供试品溶液。测得效价后，再根据装量差异项下的平均装量，计算出平均每袋（包）的效价，根据表示量即可算出含量。 软膏剂、眼膏剂 擦净软膏剂或眼膏剂软管的外壁，切开封口，置于干燥器内约1h，取干燥的洁净分液漏斗，戴手套操作，将膏剂软管连同内容物在天平

50、上称重，取出，将内容物挤入分液漏斗，量约2g，再称取膏剂软管的重量，按减重法以前后称量之差计算分液漏斗内膏剂供试品的量，以不含过氧化物的乙醚或石油醚等作溶剂溶解基质，但基质中的抗生素则应不溶于或几乎不溶于该有机溶剂中，以避免提取过程中抗生素的损失。按标准中的规定加提取溶剂至分液漏斗中，振摇，使基质溶解，用规定的缓冲溶液提取抗生素至水相中，用缓冲溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加缓冲溶液至刻度，摇匀，量取适量稀释至规定的浓度，滴加双碟，培养，测量抑菌圈，数据处理，可靠性测验及可信限率判断，计算效价。4 参考或引用文件中国药品检验标准操作规程2010年版5 附件抗生素微生物检定标准操作规

51、程考核试题 Z-TM-GM042-T（00）抗生素微生物检定标准操作规程考核试题答案 Z-TM-GM042-A（00）6 修订历史文件编号版本号修订内容生效日期抗生素微生物检定标准操作规程考核试题部门： 编号： 姓名： 日期： 得分： 一、名词解释：抗生素微生物检定法：二、填空题：1、抗生素微生物检定包括两种方法，即 和 。2、已接种的细菌管置 培养 h，霉菌管一般置 培养 h霉菌培养箱内培养7天。3、培养基应新鲜制备，如斜面已 冷凝水者，不宜再使用。4、观察试验菌的生长曲线，测定时间应处在试验菌的 生长期内，且测定的吸光度应在 之间。5、测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的 或高于估计

52、效价的 时，应调整其估计效价，重新试验。6、管碟法系根据量 原理而设计，并要求在试验所用的剂量范围内，对数剂量与反应呈 关系。三、选择题：1、除另有规定外，抗生素微生物检定法的可信限率不得大于 。A、10 B、15 C、5 D、9 2、培养后放入 冷藏箱内保存，一般 13 个月转种一次。A、0 B、4 C、7 D、10 3、从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约 min，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。A、20 B、15 C、25 D、30四、简答题：如何进行抑菌圈测量？抗生素微生物检定标准操作规程考核试题答案部门： 编号： 姓名： 日期： 得分： 一、名词解释：抗生素微生物检定法：本

53、法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。二、填空题：1、抗生素微生物检定包括两种方法，即 管碟法 和 浊度法 。2、已接种的细菌管置 3537 培养 2224 h，霉菌管一般置 2425 培养 2425 h霉菌培养箱内培养7天。3、培养基应新鲜制备，如斜面已 无 冷凝水者，不宜再使用。4、观察试验菌的生长曲线，测定时间应处在试验菌的 对数 生长期内，且测定的吸光度应在 0.30.7 之间。5、测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的 90 或高于估计效价的 110 时，应调整其估计效价，重新试验。6、管碟法系根据量 反应平行

54、线 原理而设计，并要求在试验所用的剂量范围内，对数剂量与反应呈 直线 关系。三、选择题：1、除另有规定外，抗生素微生物检定法的可信限率不得大于 C 。A、10 B、15 C、5 D、9 2、培养后放入 B 冷藏箱内保存，一般 13 个月转种一次。A、0 B、4 C、7 D、10 3、从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约 D min，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。A、20 B、15 C、25 D、30抗生素微生物检定标准操作规程考核试题答案部门： 编号： 姓名： 日期： 得分： 四、简答题：如何进行抑菌圈测量？答：将培养好的双碟取出，拿掉陶瓦盖，将钢管倒入盛有1：1000新洁尔灭溶液或其它消毒液内灭菌，换以玻璃盖；测量抑菌圈前，应检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或圈不完整，应舍弃该碟，切忌主观挑选双碟或抑菌圈，以免造成测定结果的偏倚。测量抑菌圈可以使用抑菌圈测量仪，也可用游标卡尺；使用的抑菌圈测量仪应经过检定，并符合检定规程要求，操作时应按仪器的操作规程进行；使用游标卡尺测量时，眼睛视线应与读数刻度垂直，用卡尺的尖端与抑菌圈直径的切点成垂直方向测量。