嗜水气单胞菌铁离子限制下差异外膜蛋白质组学及其免疫保护性评价

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1、嗜水气单胞菌铁离子限制下差异外膜蛋白质组学及其免疫保护性评价嗜水气单胞菌(Aeromona hydrophila)是一种典型的人-鱼-兽共患病的条 件致病菌,可引发鱼类患出血性败血症。每年由于该菌导致的流行性疾病给水产 养殖业造成巨大的经济损失，严重阻碍着养殖业的发展。在养殖业中,针对该菌引发的疾病，常见的防治措施是抗生素防治，导致细菌 的耐药性日益增强。近年来由于疫苗相关技术的快速发展，以及其高效的抑菌或 杀菌效果，使之正成为替换抗生素的重要防治措施之一。但是当前疫苗的种类并不多，制约着疫苗的广泛使用。因此，寻找具有免疫原 性的保护蛋白，开发新型疫苗，对防治该菌引发的疾病以及抑制其耐药性的蔓

2、延 具有重要的现实意义。以往文献报道，细菌的外膜蛋白组分可作为鱼类疫苗的候选蛋白，但多集中 在对体外营养富集培养基中表达量较高的少数几个外膜蛋白的研究上，对自然条 件下表达的外膜蛋白免疫保护性质研究较为缺乏。而细菌在入侵宿主时,往往处 于局部缺铁的环境中，细菌表达特定外膜蛋白并在与宿主竞争铁离子或者参与细 胞内部铁离子平衡中起重要的生物学功能。对这些相关外膜蛋白在缺铁环境中的表达及免疫保护特性的研究，有望成为 候选蛋白，为当前新型疫苗的开发提供有效候选抗原。本研究利用定量蛋白质组 学和分子生物学方法，模拟自然条件下的缺铁环境，分析嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)在正常

3、和缺铁培养基中外膜蛋白的变化差异。采用TMT标记与质谱联用的方法比较两种状态下的月桂酰肌氨酸钠不溶性 蛋白组分，共鉴定到682个蛋白，发现有174个表达差异蛋白，其中91个上调表达 和83个下调表达，并分别包含21个和10个外膜蛋白。结合生物信息学分析发现, 下调蛋白中多数是核糖体蛋白，其主要功能是参与RNA聚合;而上调蛋白主要是 铁载体受体蛋白、铁色素载体受体、血红素受体等外膜蛋白以及一些参与抗生素 和次生代谢产物合成的蛋白。为验证外膜蛋白在铁离子限制条件下的变化，本论文运用分子生物学技术对 AHA0972(A0KGW8)、AHA427(A0KQZ1)、AHA3963(A0KQ46)、 AH

4、A0461 (A0KFG8)和 AHA1663 (A0KIU8)等五个外膜 蛋白的相应基因进行体外PCR扩增，利用pET-32a原核表达载体构建相应的重组 质粒，成功克隆并获得了高表达菌株。将上述蛋白高表达并纯化，免疫小鼠获得相 应的抗体,经检测其效价均达到1:8000以上。Western Blotting分析发现，在嗜水气单胞菌ATCC 7966及强毒株LP-1中， 以上五个外膜蛋白在正常培养基下为低丰度蛋白，而在缺铁条件下表达水平显著 增加，与质谱分析的结果一致，提示它们可能在铁离子动态平衡中起着重要作用。 最后,为检验铁离子相关外膜蛋白对鱼类是否具有免疫保护性，本论文首先提取 嗜水气单胞

5、菌ATCC 7966和LP-1正常和缺铁状态下的外膜蛋白分别免疫斑马鱼, 并选用嗜水气单胞菌鱼源强毒株LP-1进行攻毒实验，以BSA+佐剂为对照,结果表 明免疫嗜水气单胞菌ATCC 7966正常和缺铁状态下外膜蛋白的斑马鱼生存率分别 为60%和63.3%，相对免疫保护率分别为53.8%和57.6%;免疫嗜水气单胞菌LP-1 相同处理下的外膜蛋白的生存率分别为63.3%和66.6%，相对免疫保护率分别为 57.6%和61.5%;对照组(BSA+佐剂)最终生存率为13.33%,提示缺铁状态下的外 膜蛋白组分免疫保护性比正常状态下高。另外，进一步对A0KGW8、A0KQ46、A0KQZ1、A0KIU8和A0KFG8这五个铁载体 受体外膜相关蛋白进行免疫评价。将这些蛋白进行高表达并纯化,对斑马鱼进行 免疫，然后利用嗜水气单胞菌LP-1强毒株进行攻毒，其生存率分别为46.7%、 63.3%、63.3%、73.3%和66.7%，而对照组（BSA+佐剂）为16.7%;相对免疫保护率 分别为 36%、56%、56%、68%和 60%。上述结果表明，除A0KGW8效果较弱以外，其他四个蛋白都具备良好的免疫保 护性，可作为嗜水气单胞菌亚单位疫苗的候选蛋白，同时提示利用定量蛋白质组 学方法寻找潜在免疫保护性抗原是筛选鱼类候选疫苗有效的策略之一。