十四种传染病防治技术规范

《十四种传染病防治技术规范》由会员分享，可在线阅读，更多相关《十四种传染病防治技术规范（245页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、十四种传传染病防防治技术规范范灵台县动动物疾病病预防控控制中心心目 录录一、高致致病性禽禽流感防防治技术术规范1二、口蹄蹄疫防治治技术规规范335三、马传传染性贫贫血防治治技术规规范554四、马鼻鼻疽防治治技术规规范665五、布鲁鲁氏菌病病防治技技术规范范883六、牛结结核病防防治技术术规范89七、猪伪伪狂犬病病防治技技术规范范944八、猪瘟瘟防治技技术规范范997九、新城城疫防治治技术规规范1113十、传染染性法氏氏囊病防防治技术术规范1211十一、马马立克氏氏病防治治技术规规范1226十二、绵绵羊痘/山羊痘痘防治技技术规范范1130十三、炭炭疽防治治技术规规范1334十四、JJ-亚群群禽白

2、血血病防治治技术规规范1143242一、高致致病性禽禽流感防防治技术术规范高致病性性禽流感感（Hiighlly PPathhogeenicc Avviann Innfluuenzza, HPAAI）是是由正粘粘病毒科科流感病病毒属AA型流感感病毒引引起的以以禽类为为主的烈烈性传染染病。世世界动物物卫生组组织（OOIE）将将其列为为必须报报告的动动物传染染病，我我国将其其列为一一类动物物疫病。为预防、控控制和扑扑灭高致致病性禽禽流感，依依据中中华人民民共和国国动物防防疫法、重重大动物物疫情应应急条例例、国国家突发发重大动动物疫情情应急预预案及及有关的的法律法法规制定定本规范范。1 适用用范围本规

3、范规规定了高高致病性性禽流感感的疫情情确认、疫疫情处置置、疫情情监测、免免疫、检检疫监督督的操作作程序、技技术标准准及保障障措施。本规范适适用于中中华人民民共和国国境内一一切与高高致病性性禽流感感防治活活动有关关的单位位和个人人。2 诊断断2.1 流行病病学特点点2.1.1 鸡、火火鸡、鸭鸭、鹅、鹌鹌鹑、雉雉鸡、鹧鹧鸪、鸵鸵鸟、孔孔雀等多多种禽类类易感，多多种野鸟鸟也可感感染发病病。2.1.2 传染源源主要为为病禽（野野鸟）和和带毒禽禽（野鸟鸟）。病病毒可长长期在污污染的粪粪便、水水等环境境中存活活。2.1.3 病毒传传播主要要通过接接触感染染禽（野野鸟）及及其分泌泌物和排排泄物、污污染的饲饲

4、料、水水、蛋托托（箱）、垫垫草、种种蛋、鸡鸡胚和精精液等媒媒介，经经呼吸道道、消化化道感染染，也可可通过气气源性媒媒介传播播。2.2 临床床症状2.2.1 急性发发病死亡亡或不明明原因死死亡，潜潜伏期从从几小时时到数天天，最长长可达221天；2.2.2 脚鳞出出血；2.2.3 鸡冠出出血或发发绀、头头部和面面部水肿肿；2.2.4 鸭、鹅鹅等水禽禽可见神神经和腹腹泻症状状，有时时可见角角膜炎症症，甚至至失明；2.2.5 产蛋突突然下降降。2.3 病理理变化2.3.1 消化道道、呼吸吸道粘膜膜广泛充充血、出出血；腺腺胃粘液液增多，可可见腺胃胃乳头出出血，腺腺胃和肌肌胃之间间交界处处粘膜可可见带状状

5、出血；2.3.2 心冠及及腹部脂脂肪出血血；2.3.3 输卵管管的中部部可见乳乳白色分分泌物或或凝块；卵泡充充血、出出血、萎萎缩、破破裂,有有的可见见“卵黄性性腹膜炎炎”；2.3.4脑部部出现坏坏死灶、血血管周围围淋巴细细胞管套套、神经经胶质灶灶、血管管增生等等病变；胰腺和和心肌组组织局灶灶性坏死死。2.4 血清清学指标标2.4.1 未免疫疫禽H55或H77的血凝凝抑制(HI)效价达达到244及以上上（附件件1）；2.4.2 禽流感感琼脂免免疫扩散散试验（AAGIDD）阳性性(附件件2)。2.5 病原原学指标标2.5.1 反转录录-聚合合酶链反反应（RRT-PPCR）检检测，结结果H55或H7

6、7亚型禽禽流感阳阳性（附附件4）；2.5.2 通用荧荧光反转转录-聚聚合酶链链反应（荧荧光RTT-PCCR）检检测阳性性（附件件6）；2.5.3 神经氨氨酸酶抑抑制（NNI）试试验阳性性（附件件3）；2.5.4 静脉内内接种致致病指数数（IVVPI）大大于1.2或用用0.22ml 1:110稀释释的无菌菌感染流流感病毒毒的鸡胚胚尿囊液液，经静静脉注射射接种88只4-8周龄龄的易感感鸡，在在接种后后10天天内，能能致6-7只或或8只鸡鸡死亡，即即死亡率率75%；2.5.5 对血凝凝素基因因裂解位位点的氨氨基酸序序列测定定结果与与高致病病性禽流流感分离离株基因因序列相相符（由由国家参参考实验验室提

7、供供方法）。2.6 结果果判定2.6.1 临临床怀疑疑病例符合流行行病学特特点和临临床指标标2.22.1，且且至少符符合其他他临床指指标或病病理指标标之一的的;非免疫禽禽符合流流行病学学特点和和临床指指标2.2.11且符合合血清学学指标之之一的。2.6.2 疑疑似病例例临床怀疑疑病例且且符合病病原学指指标2.5.11、2.5.22、2.5.33之一。2.6.3 确确诊病例例疑似病例例且符合合病原学学指标22.5.4或22.5.5。3 疫疫情报告告3.1 任何何单位和和个人发发现禽类类发病急急、传播播迅速、死死亡率高高等异常常情况，应应及时向向当地动动物防疫疫监督机机构报告告。3.2 当地地动物

8、防防疫监督督机构在在接到疫疫情报告告或了解解可疑疫疫情情况况后，应应立即派派员到现现场进行行初步调调查核实实并采集集样品，符符合2.6.11规定的的，确认认为临床床怀疑疫疫情；3.3 确认认为临床床怀疑疫疫情的，应应在2个个小时内内将情况况逐级报报到省级级动物防防疫监督督机构和和同级兽兽医行政政管理部部门，并并立即将将样品送送省级动动物防疫疫监督机机构进行行疑似诊诊断；3.4 省级级动物防防疫监督督机构确确认为疑疑似疫情情的，必必须派专专人将病病料送国国家禽流流感参考考实验室室做病毒毒分离与与鉴定，进进行最终终确诊；经确认认后，应应立即上上报同级级人民政政府和国国务院兽兽医行政政管理部部门，国

9、国务院兽兽医行政政管理部部门应当当在4个个小时内内向国务务院报告告；3.5 国务务院兽医医行政管管理部门门根据最最终确诊诊结果，确确认高致致病性禽禽流感疫疫情。4 疫情情处置4.1 临床怀怀疑疫情情的处置置对发病场场（户）实实施隔离离、监控控，禁止止禽类、禽禽类产品品及有关关物品移移动，并并对其内内、外环环境实施施严格的的消毒措措施（附附件8）。4.2 疑似疫疫情的处处置当确认为为疑似疫疫情时，扑扑杀疑似似禽群，对对扑杀禽禽、病死死禽及其其产品进进行无害害化处理理，对其其内、外外环境实实施严格格的消毒毒措施，对对污染物物或可疑疑污染物物进行无无害化处处理，对对污染的的场所和和设施进进行彻底底消

10、毒，限限制发病病场（户户）周边边3公里里的家禽禽及其产产品移动动（见附附件9、110）。4.3 确诊疫疫情的处处置疫情确诊诊后立即即启动相相应级别别的应急急预案。4.3.1 划定疫疫点、疫疫区、受受威胁区区由所在地地县级以以上兽医医行政管管理部门门划定疫疫点、疫疫区、受受威胁区区。疫点：指指患病动动物所在在的地点点。一般般是指患患病禽类类所在的的禽场（户户）或其其它有关关屠宰、经经营单位位；如为为农村散散养，应应将自然然村划为为疫点。疫区：由由疫点边边缘向外外延伸33公里的的区域划划为疫区区。疫区区划分时时，应注注意考虑虑当地的的饲养环环境和天天然屏障障（如河河流、山山脉等）。受威胁区区：由疫

11、疫区边缘缘向外延延伸5公公里的区区域划为为受威胁胁区。4.3.2 封锁由县级以以上兽医医主管部部门报请请同级人人民政府府决定对对疫区实实行封锁锁；人民民政府在在接到封封锁报告告后，应应在244小时内内发布封封锁令，对对疫区进进行封锁锁：在疫疫区周围围设置警警示标志志，在出出入疫区区的交通通路口设设置动物物检疫消消毒站，对对出入的的车辆和和有关物物品进行行消毒。必必要时，经经省级人人民政府府批准，可可设立临临时监督督检查站站，执行行对禽类类的监督督检查任任务。跨行政区区域发生生疫情的的，由共共同上一一级兽医医主管部部门报请请同级人人民政府府对疫区区发布封封锁令，对对疫区进进行封锁锁。4.3.3

12、疫疫点内应应采取的的措施4.3.3.11 扑杀杀所有的的禽只，销销毁所有有病死禽禽、被扑扑杀禽及及其禽类类产品；4.3.3.22 对禽禽类排泄泄物、被被污染饲饲料、垫垫料、污污水等进进行无害害化处理理；4.3.3.33 对被被污染的的物品、交交通工具具、用具具、禽舍舍、场地地进行彻彻底消毒毒。4.3.4 疫疫区内应应采取的的措施4.3.4.11扑杀疫疫区内所所有家禽禽，并进进行无害害化处理理，同时时销毁相相应的禽禽类产品品；4.3.4.22 禁止止禽类进进出疫区区及禽类类产品运运出疫区区；4.3.4.33 对禽禽类排泄泄物、被被污染饲饲料、垫垫料、污污水等按按国家规规定标准准进行无无害化处处理

13、；4.3.4.44 对所所有与禽禽类接触触过的物物品、交交通工具具、用具具、禽舍舍、场地地进行彻彻底消毒毒。4.3.5 受受威胁区区内应采采取的措措施4.3.5.11 对所所有易感感禽类进进行紧急急强制免免疫，建建立完整整的免疫疫档案；4.3.5.22 对对所有禽禽类实行行疫情监监测，掌掌握疫情情动态。4.3.6 关闭疫疫点及周周边133公里内内所有家家禽及其其产品交交易市场场。4.3.7 流行病病学调查查、疫源源分析与与追踪调调查追踪疫点点内在发发病期间间及发病病前211天内售售出的所所有家禽禽及其产产品，并并销毁处处理。按按照高致致病性禽禽流感流流行病学学调查规规范，对对疫情进进行溯源源和

14、扩散散风险分分析（附附件111）。4.3.8 解除封封锁4.3.8.11 解除除封锁的的条件疫点、疫疫区内所所有禽类类及其产产品按规规定处理理完毕221天以以上，监监测未出出现新的的传染源源；在当当地动物物防疫监监督机构构的监督督指导下下，完成成相关场场所和物物品终末末消毒；受威胁胁区按规规定完成成免疫。4.3.8.22 解除除封锁的的程序经上一级级动物防防疫监督督机构审审验合格格，由当当地兽医医主管部部门向原原发布封封锁令的的人民政政府申请请发布解解除封锁锁令，取取消所采采取的疫疫情处置置措施。4.3.8.33 疫区区解除封封锁后，要要继续对对该区域域进行疫疫情监测测，6个个月后如如未发现现

15、新病例例，即可可宣布该该次疫情情被扑灭灭。疫情情宣布扑扑灭后方方可重新新养禽。4.3.9 对对处理疫疫情的全全过程必必须做好好完整详详实的记记录，并并归档。5 疫情情监测5.1 监测方方法包括括临床观观察、实实验室检检测及流流行病学学调查。5.2 监测对对象以易易感禽类类为主，必必要时监监测其他他动物。5.3监监测的范范围5.3.1 对养禽禽场户每每年要进进行两次次病原学学抽样检检测，散散养禽不不定期抽抽检，对对于未经经免疫的的禽类以以血清学学检测为为主；5.3.2 对对交易市市场、禽禽类屠宰宰厂（场场）、异异地调入入的活禽禽和禽产产品进行行不定期期的病原原学和血血清学监监测。5.3.3 对对

16、疫区和和受威胁胁区的监监测5.3.3.11 对疫疫区、受受威胁区区的易感感动物每每天进行行临床观观察，连连续1个个月，病病死禽送送省级动动物防疫疫监督机机构实验验室进行行诊断，疑疑似样品品送国家家禽流感感参考实实验室进进行病毒毒分离和和鉴定。解除封锁锁前采样样检测11次，解解除封锁锁后纳入入正常监监测范围围；5.3.3.22 对疫疫区养猪猪场采集集鼻腔拭拭子，疫疫区和受受威胁区区所有禽禽群采集集气管拭拭子和泄泄殖腔拭拭子，在在野生禽禽类活动动或栖息息地采集集新鲜粪粪便或水水样，每每个采样样点采集集20份份样品，用用RT-PCRR方法进进行病原原检测，发发现疑似似感染样样品，送送国家禽禽流感参参

17、考实验验室确诊诊。5.5 在监测测过程中中，国家家规定的的实验室室要对分分离到的的毒株进进行生物物学和分分子生物物学特性性分析与与评价，密密切注意意病毒的的变异动动态，及及时向国国务院兽兽医行政政管理部部门报告告。5.6 各级动动物防疫疫监督机机构对监监测结果果及相关关信息进进行风险险分析，做做好预警警预报。5.7监监测结果果处理监测结果果逐级汇汇总上报报至中国国动物疫疫病预防防控制中中心。发发现病原原学和非非免疫血血清学阳阳性禽，要要按照国国家动物物疫情报报告管理理办法的的有关规规定立即即报告，并并将样品品送国家家禽流感感参考实实验室进进行确诊诊，确诊诊阳性的的，按有有关规定定处理。6 免疫

18、疫6.1 国家对对高致病病性禽流流感实行行强制免免疫制度度，免疫疫密度必必须达到到1000%，抗抗体合格格率达到到70%以上。6.2 预防性性免疫，按按农业部部制定的的免疫方方案中规规定的程程序进行行。6.3 突发疫疫情时的的紧急免免疫，按按本规范范有关条条款进行行。6.4 所用疫疫苗必须须采用农农业部批批准使用用的产品品，并由由动物防防疫监督督机构统统一组织织、逐级级供应。6.5 所有易易感禽类类饲养者者必须按按国家制制定的免免疫程序序做好免免疫接种种，当地地动物防防疫监督督机构负负责监督督指导。6.6 定期对对免疫禽禽群进行行免疫水水平监测测，根据据群体抗抗体水平平及时加加强免疫疫。7 检

19、疫疫监督7.1产产地检疫疫饲养者在在禽群及及禽类产产品离开开产地前前，必须须向当地地动物防防疫监督督机构报报检，接接到报检检后，必必须及时时到户、到到场实施施检疫。检检疫合格格的，出出具检疫疫合格证证明，并并对运载载工具进进行消毒毒，出具具消毒证证明，对对检疫不不合格的的按有关关规定处处理。7.2屠屠宰检疫疫动物防疫疫监督机机构的检检疫人员员对屠宰宰的禽只只进行验验证查物物，合格格后方可可入厂（场场）屠宰宰。宰后后检疫合合格的方方可出厂厂，不合合格的按按有关规规定处理理。7.3引引种检疫疫国内异地地引入种种禽、种种蛋时，应应当先到到当地动动物防疫疫监督机机构办理理检疫审审批手续续且检疫疫合格。

20、引引入的种种禽必须须隔离饲饲养211天以上上，并由由动物防防疫监督督机构进进行检测测，合格格后方可可混群饲饲养。7.4监监督管理理7.4.1禽类类和禽类类产品凭凭检疫合合格证运运输、上上市销售售。动物物防疫监监督机构构应加强强流通环环节的监监督检查查，严防防疫情传传播扩散散。7.4.2生产产、经营营禽类及及其产品品的场所所必须符符合动物物防疫条条件，并并取得动动物防疫疫合格证证。7.4.3各地地根据防防控高致致病性禽禽流感的的需要设设立公路路动物防防疫监督督检查站站，对禽禽类及其其产品进进行监督督检查，对对运输工工具进行行消毒。8 保障障措施8.1 各级政政府应加加强机构构队伍建建设，确确保各

21、项项防治技技术落实实到位。8.2 各级财财政和发发改部门门应加强强基础设设施建设设，确保保免疫、监监测、诊诊断、扑扑杀、无无害化处处理、消消毒等防防治工作作经费落落实。8.3 各级兽兽医行政政部门动动物防疫疫监督机机构应按按本技术术规范，加加强应急急物资储储备，及及时演练练和培训训应急队队伍。8.4 在高致致病禽流流感防控控中，人人员的防防护按高高致病性性禽流感感人员防防护技术术规范执执行（附附件122）。附件1血凝抑制制（HII）试验验流感病毒毒颗粒表表面的血血凝素（HHA）蛋蛋白，具具有识别别并吸附附于红细细胞表面面受体的的结构，HHA试验验由此得得名。HHA蛋白白的抗体体与受体体的特异异

22、性结合合能够干干扰HAA蛋白与与红细胞胞受体的的结合从从而出现现抑制现现象。该试验是是目前WWHO进进行全球球流感监监测所普普遍采用用的试验验方法。可可用于流流感病毒毒分离株株HA亚亚型的鉴鉴定，也也可用来来检测禽禽血清中中是否有有与抗原原亚型一一致的感感染或免免疫抗体体。HA-HHI试验验的优点点是目前前WHOO进行全全球流感感监测所所普遍采采用的试试验方法法，可用用来鉴定定所有的的流感病病毒分离离株，可可用来检检测禽血血清中的的感染或或免疫抗抗体。它它的缺点点是只有有当抗原原和抗体体HA亚亚型相一一致时才才能出现现HI象象，各亚亚型间无无明显交交叉反应应；除鸡鸡血清以以外，用用鸡红细细胞检

23、测测哺乳动动物和水水禽的血血清时需需要除去去存在于于血清中中的非特特异凝集集素，对对于其它它禽种，也也可以考考虑选用用在调查查研究中中的禽种种红细胞胞；需要要在每次次试验时时进行抗抗原标准准化；需需要正确确判读的的技能。1 阿阿氏（AAlseeverrs）液液配制称量葡萄萄糖2.05gg、柠檬檬酸钠00.8gg、柠檬檬酸0.0555g、氯氯化钠00.422g，加加蒸馏水水至1000mLL，散热热溶解后后调pHH值至66.1，669kPPa 115miin高压压灭菌，4保存备用。2 110%和和1%鸡鸡红细胞胞液的制制备2.1采采血 用注射射器吸取取阿氏液液约1mmL，取取至少22只SPPF鸡（

24、如如果没有有SPFF鸡，可可用常规规试验证证明体内内无禽流流感和新新城疫抗抗体的鸡鸡），采采血约224mmL，与与阿氏液液混合，放放入装110mLL阿氏液液的离心心管中混混匀。2.2 洗涤鸡鸡红细胞胞 将将离心管管中的血血液经11500018800 r/mmin 离心88分钟，弃弃上清液液，沉淀淀物加入入阿氏液液，轻轻轻混合，再再经1550018000 rr/miin离心心8分钟钟，用吸吸管移去去上清液液及沉淀淀红细胞胞上层的的白细胞胞薄膜，再再重复22次以上上过程后后，加入入阿氏液液20 mL，轻轻轻混合合成红细细胞悬液液，4保存备备用，不不超过55天。2.3 100%鸡红红细胞悬悬液 取阿

25、氏氏液保存存不超过过5天的的红细胞胞，在锥锥形刻度度离心管管中离心心15000118000 r/minn 8分分钟，弃弃去上清清液，准准确观察察刻度离离心管中中红细胞胞体积(mL)，加入入9倍体体积(mmL)的的生理盐盐水，用用吸管反反复吹吸吸使生理理盐水与与红细胞胞混合均均匀。2.4 1%鸡红细细胞液 取混混合均匀匀的100%鸡红红细胞悬悬液1 mL，加加入9 mL生生理盐水水，混合合均匀即即可。3 抗原原血凝效效价测定定（HAA试验，微微量法）3.1 在微量量反应板板的1孔孔122孔均加加入0.0255mL PBSS，换滴滴头。3.2吸吸取0.0255mL病病毒悬液液（如感感染性鸡鸡胚尿囊

26、囊液）加加入第ll孔，混混匀。3.3从从第1孔孔吸取00.0225mLL病毒液液加入第第2孔，混混匀后吸吸取0.0255mL加加入第33孔，如如此进行行对倍稀稀释至第第11孔孔，从第第11孔孔吸取00.0225mLL弃之，换换滴头。3.4每每孔再加加入0.0255mL PBSS。3.5每每孔均加加入0.0255mL 体积分分数为11%鸡红红细胞悬悬液（将将鸡红细细胞悬液液充分摇摇匀后加加入）见见附录BB。3.6振振荡混匀匀，在室室温（220225）下静静置400minn后观察察结果（如如果环境境温度太太高，可可置4环境下下反应11小时）。对对照孔红红细胞将将呈明显显的钮扣扣状沉到到孔底。3.7

27、结结果判定定 将将板倾斜斜，观察察血凝板板，判读读结果（见见下表）。表1：血血凝试验验结果判判读标准准类别孔 底底 所所 见见结果12345红细胞全全部凝集集，均匀匀铺于孔孔底，即即1000%红细细胞凝集集红细胞凝凝集基本本同上，但但孔底有有大圈红细胞于于孔底形形成中等等大的圈圈，四周周有小凝凝块红细胞于于孔底形形成小圆圆点，四四周有少少许凝集集块红细胞于于孔底呈呈小圆点点，边缘缘光滑整整齐，即即红细胞胞完全不不凝集+-能使红细细胞完全全凝集（1100%凝集，+）的抗抗原最高高稀释度度为该抗抗原的血血凝效价价，此效效价为11个血凝凝单位（HHAU）。注注意对照照孔应呈呈现完全全不凝集集（-），

28、否否则此次次检验无无效。4 血凝凝抑制（HHI）试试验（微微量法）4.1 根据33的试验验结果配配制4HHAU的的病毒抗抗原。以以完全血血凝的病病毒最高高稀释倍倍数作为为终点，终终点稀释释倍数除除以4即即为含44HAUU的抗原原的稀释释倍数。例例如，如如果血凝凝的终点点滴度为为1:2256，则则4HAAU抗原原的稀释释倍数应应是1:64（2256除除以4）。4.2 在微量量反应板板的1孔孔111孔加入入0.0025mmL PPBS，第第12孔孔加入00.055mL PBSS。4.3 吸取00.0225mLL血清加加入第11孔内，充充分混匀匀后吸00.0225mLL于第22孔，依依次对倍倍稀释至

29、至第100孔，从从第100孔吸取取0.0025mmL弃去去。4.4 1孔11孔孔均加入入含4HHAU混混匀的病病毒抗原原液0.0255mL，室室温（约约20）静置置至少330miin。4.5 每孔加加入0.0255mL体体积分数数为1%的鸡红红细胞悬悬液混匀匀，轻轻轻混匀，静静置约440miin（室室温约220，若环环境温度度太高可可置4条件下下进行），对对照红细细胞将呈呈现钮扣扣状沉于于孔底。4.6 结果判判定以完全抑抑制4个个HAUU抗原的的血清最最高稀释释倍数作作为HII滴度。只有阴性性对照孔孔血清滴滴度不大大于211og22，阳性性对照孔孔血清误误差不超超过1个个滴度，试试验结果果才有

30、效效。HII价小于于或等于于21oog2判判定HII试验阴阴性；HHI价等等于311og22为可疑疑，需重重复试验验；HII价大于于或等于于41oog2为为阳性。附件2琼脂凝胶胶免疫扩扩散（AAGIDD）试验验A型流感感病毒都都有抗原原性相似似的核衣衣壳和基基质抗原原。用已已知禽流流感AGGID标标准血清清可以检检测是否否有A型型流感病病毒的存存在，一一般在鉴鉴定所分分禽的病病毒是否否是A型型禽流感感病毒时时常用，此此时的抗抗原需要要试验者者自己用用分离的的病毒制制备；利利用AGGID标标准抗原原，可以以检测所所有A型型流感病病毒产生生的各个个亚型的的禽流感感抗体，通通常在禽禽流感监监测时使使

31、用(水水禽不适适用)，可可作为非非免疫鸡鸡和火鸡鸡感染的的证据，其其标准抗抗原和阳阳性血清清均可由由国家指指定单位位提供。流流感病毒毒感染后后不是所所有的禽禽种都能能产生沉沉淀抗体体。1 抗原原制备1.1 用含丰丰富病毒毒核衣壳壳的尿囊囊膜制备备。从尿尿囊液呈呈HA阳阳性的感感染鸡胚胚中提取取绒毛尿尿囊膜，将将其匀浆浆或研碎碎，然后后反复冻冻融三次次，经110000r/mm离心110分钟钟，弃沉沉淀，取取上清液液用0.1%福福尔马林林或1%-丙内内酯灭活活后可作作为抗原原。1.2 用感染染的尿囊囊液将病病毒浓缩缩或者用用已感染染的绒毛毛尿囊膜膜的提取取物，这这些抗原原用标准准血清进进行标定定。

32、将含含毒尿囊囊液以超超速离心心或者在在酸性条条件下进进行沉淀淀以浓缩缩病毒。酸性沉淀淀法是将将1.00moll/LHHCl加加入到含含毒尿囊囊液中，调调pH值值到4.0，将将混合物物置于冰冰浴中作作用1小小时，经经10000r/m，44离心110分钟钟，弃去去上清液液。病毒毒沉淀物物悬于甘甘氨-肌肌氨酸缓缓冲液中中（含11%十二二烷酰肌肌氨酸缓缓冲液，用用0.55 mool/LL甘氨酸酸调pHH值至99.0）。沉沉淀物中中含有核核衣壳和和基质多多肽。2 琼脂脂板制备备该试验常常用1gg优质琼琼脂粉或或0.881gg 琼脂脂糖加入入1000 mLL0.001mool/LL、pHH值7.2的88%

33、氯化化钠-磷磷酸缓冲冲液中，水水浴加热热融化，稍稍凉（660665），倒倒入琼脂脂板内（厚厚度为33mm），待待琼脂凝凝固后，4冰箱保存备用。用打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3 mm 4mm，孔距为3mm。3 加样样用移液器器滴加抗抗原于中中间孔，周周围1、44孔加阳阳性血清清，其余余孔加被被检血清清，每孔孔均以加加满不溢溢出为度度，每加加一个样样品应换换一个滴滴头,并并设阴性性对照血血清。4 感作作将琼脂板板加盖保保湿，置置于377温箱。224448小时时后，判判定结果果。5 结果果判定5.1 阳性。阳阳性血清清与抗原原孔之间间有明显显沉淀线线时，被被检血清清与抗原原孔之间间也形

34、成成沉淀线线，并与与阳性血血清的沉沉淀线末末端吻合合，则被被检血清清判为阳阳性。5.2 弱阳性性。被检检血清与与抗原孔孔之间没没有沉淀淀线，但但阳性血血清的沉沉淀线末末端向被被检血清清孔偏弯弯，此被被检血清清判为弱弱阳性（需需重复试试验）。5.3 阴性性。被检检血清与与抗原孔孔之间不不形成沉沉淀线，且且阳性血血清沉淀淀线直向向被检血血清孔，则则被检血血清判为为阴性。附件3神经氨酸酸酶抑制制（NII）试验验神经氨酸酸酶是流流感病毒毒的两种种表面糖糖蛋白之之一，它它具有酶酶的活性性。NAA与底物物(胎球球蛋白)混合，37温育过夜，可使胎球蛋白释放出唾液酸，唾液酸经碘酸盐氧化，经硫代巴比妥酸作用形成

35、生色团，该生色团用有机溶剂提取后便可用分光光度计测定。反应中出现的粉红色深浅与释放的唾液酸的数量成比例，即与存在的流感病毒的数量成比例。在进行病病毒NAA亚型鉴鉴定时，当当已知的的标准NNA分型型抗血清清与病毒毒NA亚亚型一致致时，抗抗血清就就会将NNA中和和，从而而减少或或避免了了胎球蛋蛋白释放放唾液酸酸，最后后不出现现化学反反应，即即看不到到粉红色色出现，则则表明血血清对NNA抑制制阳性。该试验可可用于分分离株NNA亚型型的鉴定定，也可可用于血血清中NNI抗体体的定性性测定。1 溶溶液配置置1.1胎胎球蛋白白：488-500mg/ml; 1.2过过碘酸盐盐：4.28克克过碘酸酸钠+338

36、mml无离离子水+62 ml浓浓正磷酸酸，充分分混合，棕棕色瓶存存放；1.3砷砷试剂：10克克亚砷酸酸钠+77.1克克无水硫硫酸钠+1000 mll无离子子水+00.3 ml 浓硫酸酸；1.4硫硫代巴比比妥酸：1.22克硫代代巴比妥妥酸+114.22克无水水硫酸钠钠+2000 mml无离离子水，煮煮沸溶解解，使用用期一周周。2 操操作方法法2.1 按下图图所示标标记试管管N1原液液 NN1 110倍 N1 1000倍 N1 10000倍N2原液液 NN2 110倍 N2 1000倍 N2 10000倍阴性血清清原液 阴性性血清110倍 阴性性血清1100倍倍 阴阴性血清清10000倍2.2 将

37、NN1、NN2标准准阳性血血清和阴阴性血清清分别按按原液、110倍、1100倍倍稀释，并并分别加加入标记记好的相相应试管管中。2.3 将已已经确定定HA亚亚型的待待检鸡胚胚尿囊液液稀释至至HA价价为166倍，每每管均加加入0.05mml，混混匀377水浴11小时。2.4 每管管加入的的胎球蛋蛋白溶液液（500mg/ml）00.1mml，混混匀，拧拧上盖后后37水浴116-118小时时。2.5 室温温冷却后后，每管管加入00.1mml过碘碘酸盐混混匀，室室温静置置20分分钟。2.6 每管管加入11ml砷砷试剂，振振荡至棕棕色消失失乳白色色出现。2.7 每管管加入22.5mml硫代代巴比妥妥酸试剂

38、剂，将试试管置煮煮沸的水水浴中115分钟钟，不出出现粉红红色的为为神经氨氨酸酶抑抑制阳性性，即待待检病毒毒的神经经氨酸酶酶亚型与与加入管管中的标标准神经经氨酸酶酶分型血血清亚型型一致。附件4反转录-聚合酶酶链反应应(RTT-PCCR)反转录-聚合酶酶链反应应(RTT-PCCR)适适用于检检测禽组组织、分分泌物、排排泄物和和鸡胚尿尿囊液中中禽流感感病毒核核酸。鉴鉴于RTT-PCCR方法法的敏感感性和特特异性，引引物的选选择是最最为重要要的，通通常引物物是以已已知序列列为基础础设计的的，大量量掌握国国内分离离株的序序列是设设计特异异引物的的前题和和基础。利利用RTT-PCCR的通通用引物物可以检检

39、测是否否有A型型流感病病毒的存存在，亚亚型特异异性引物物则可进进行禽流流感的分分型诊断断和禽流流感病毒毒的亚型型鉴定。1 试试剂/引引物1.1 变性性液：见见附录AA.11.2 2MM醋酸钠钠溶液(pH44.0)：见附附录A.21.3 水饱饱和酚（ppH 44.0）1.4 氯仿仿/异戊戊醇混合合液：见见附录AA.31.5 M-MLVV反转录录酶（2200uu/L）1.6 RNNA酶抑抑制剂(40uu/L)1.7 Taaq DDNA聚聚合酶(5u/L)1.8 1.0% 琼脂糖糖凝胶：见附录录A.441.9 500TAEE缓冲液液：见附附录A.51.100 溴溴化乙锭锭(100g/L)：见附录录A

40、.661.111 加加样缓冲冲液：见见附录AA.71.122 焦焦碳酸二二乙酯(DEPPC)处处理的灭灭菌双蒸蒸水：见见附录AA.81.133 55反转录录反应缓缓冲液（附附录A.9）1.144 22.5mmmoll dNNTPss（附录录A.110）1.155 110PCRR Buuffeer（附附录A.11）1.166 DDNA分分子量标标准1.177 引引物：见见附录BB2 操操作程序序2.1 样品品的采集集和处理理：按照照GB/T 1189336中提提供方法法进行。2.2 RNNA的提提取2.2.1 设立阳阳性、阴阴性样品品对照。2.2.2 异异硫氰酸酸胍一步步法2.2.2.11 向组

41、组织或细细胞中加加入适量量的变性性液，匀匀浆。2.2.2.22 将混混合物移移至一管管中，按按每毫升升变性液液中立即即加入00.1mmL乙酸酸钠，11mL酚酚，0.2mll氯仿-异戊醇醇。加入入每种组组分后，盖盖上管盖盖，倒置置混匀。2.2.2.33 将匀匀浆剧烈烈振荡110s。冰冰浴155minn使核蛋蛋白质复复合体彻彻底裂解解。2.2.2.44 1220000r/mmin，4离心20min，将上层含RNA的水相移入一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下层。2.2.2.55 加入入等体积积的异丙丙醇，充充分混匀匀液体，并并在-220沉淀RRNA 1

42、h或或更长时时间。2.2.2.66 4 1220000 r/minn离心110 mmin，弃弃上清，用用75%的乙醇醇洗涤沉沉淀，离离心，用用吸头彻彻底吸弃弃上清，自自然条件件下干燥燥沉淀，溶溶于适量量DEPPC处理理的水中中。-220贮存，备备用。2.2.3 也也可选择择市售商商品化RRNA提提取试剂剂盒，完完成RNNA的提提取。2.3反反转录2.3.1取55L RRNA，加加1L反转转录引物物，700作用55minn。2.3.2冰浴浴2miin。2.3.3继续续加入：5反转转录反应应缓冲液液 4L0.1MM DTTT 2L2.5mmmoll dNNTPss 2LM-MLLV反转转录酶 0.

43、55LRNA酶酶抑制剂剂 0.55LDEPCC水 111L 37水水浴1hh，合成成cDNNA链。取取出后可可直接进进行PCCR，或或者放于于-200保存备备用。试试验中同同时设立立阳性和和阴性对对照。2.4 PCRR根据扩增增目的不不同，选选择不同同的上/下游引引物，MM-2229U/M-2229LL是型特特异性引引物，用用于扩增增禽流感感病毒的的M基因因片段；H5-3800U/HH5-3380LL、H77-5001U/H7-5011L、HH9-7732UU/H99-7332L分分别特异异性扩增增H5、HH7、HH9亚型型血凝素素基因片片段；NN1-3358UU/N11-3558L、NN2-

44、3377UU/N22-3777L分分别特异异性扩增增N1、NN2亚型型神经氨氨酸酶基基因片段段。PCR为为50L体系系，包括括：双蒸灭菌菌水 37.5L反转录产产物 44L上游引物物 0.5L下游引物物 0.5L10PPCR Buffferr 5L2.5mmmoll dNNTPss 2LTaq酶酶 0.5L首先加入入双蒸灭灭菌水，然然后按顺顺序逐一一加入上上述成分分，每次次要加入入到液面面下。全全部加完完后，混混悬，瞬瞬时离心心，使液液体都沉沉降到PPCR管管底。在在每个PPCR管管中加入入1滴液液体石蜡蜡(约220L)。循循环参数数为9555miin，994 455s，552 455s，77

45、2 455s，循循环300次，772延伸66minn结束。设设立阳性性对照和和阴性对对照。2.5电电泳2.5.1 制制备1.0%琼琼脂糖凝凝胶板，见见附录AA.4。2.5.2 取取5 L PPCR产产物与00.5L加样样缓冲液液混合，加加入琼脂脂糖凝胶胶板的加加样孔中中。2.5.3加入入分子量量标准。2.5.4盖好好电泳仪仪，插好好电极，55V/ccm电压压电泳，330440miin。2.5.5用紫紫外凝胶胶成像仪仪观察、扫扫描图片片存档，打打印。2.5.6 用用分子量量标准比比较判断断PCRR片段大大小。3 结结果判定定3.1在在阳性对对照出现现相应扩扩增带、阴阴性对照照无此扩扩增带时时判定

46、结结果。3.2用用M-2229UU/M-2299L检测测，出现现大小为为2299bp扩扩增片段段时，判判定为禽禽流感病病毒阳性性，否则则判定为为阴性。3.3用用H5-3800U/HH5-3380LL检测，出出现大小小为3880bpp扩增片片段时，判判定为HH5血凝凝素亚型型禽流感感病毒阳阳性，否否则判定定为阴性性。3.4用用H7-5011U/HH7-5501LL检测，出出现大小小为5001bpp扩增片片段时，判判定为HH7血凝凝素亚型型禽流感感病毒阳阳性，否否则判定定为阴性性。3.5用用H9-7322U/HH9-7732LL检测，出出现大小小为7332bpp扩增片片段时，判判定为HH9血凝凝素

47、亚型型禽流感感病毒阳阳性，否否则判定定为阴性性。3.6用用N1-3588U/NN1-3358LL检测，出出现大小小为3558bpp扩增片片段时，判判定为NN1神经经氨酸酶酶亚型禽禽流感病病毒阳性性，否则则判定为为阴性。3.7用用N2-3777U/NN2-3377LL检测，出出现大小小为3777bpp扩增片片段时，判判定为NN2神经经氨酸酶酶亚型禽禽流感病病毒阳性性，否则则判定为为阴性。附 录AA相关试剂剂的配制制A.1 变性性液4M 异异硫氰酸酸胍25mMM 柠檬檬酸钠.2H22O0.5%（m/V） 十二烷烷基肌酸酸钠0.1MM-巯基基乙醇具体配制制：将2250gg异硫氰氰酸胍、0.75M（

48、PH7.0）柠檬酸钠17.6ml和26.4ml 10%（m/V）十二烷基肌酸钠溶于293ml水中。65条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下保存，每次临用前按每50ml变性液加14.4 mol/L的-巯基乙醇0.36ml的剂量加入。变性液可在室温下避光保存数月。A.2 2mmol/L醋酸酸钠溶液液(pHH4.00)乙酸钠16.44 g冰乙酸调pH至至4.00灭菌双蒸蒸水加至1000 mmLA.3 氯仿仿/异戊戊醇混合合液氯仿49 mmL异戊醇1 mLLA.4 1.0%琼琼脂糖凝凝胶的配配制琼脂糖1.0 g0.5TAEE电泳缓缓冲液加至1000 mmL微波炉中中完全融融化，待待冷至550-6

49、00时，加加溴化乙乙锭（EEB）溶溶液5L，摇摇匀，倒倒入电泳泳板上，凝凝固后取取下梳子子，备用用。A.5 500TAEE电泳缓缓冲液A.5.1 0.55moll/L 乙二铵铵四乙酸酸二钠(EDTTA)溶溶液 (pH88.0)二水乙二二铵四乙乙酸二钠钠18.661 gg灭菌双蒸蒸水80 mmL氢氧化钠钠调pH至至8.00灭菌双蒸蒸水加至1000 mmLA.5.2 TAEE电泳缓缓冲液(50)配制制羟基甲基基氨基甲甲烷(TTriss)242 g冰乙酸57.11 mLL0.5mmol/L乙二二铵四乙乙酸二钠钠溶液(PH88.0)100 mL灭菌双蒸蒸水加至1 0000 mLL用时用灭灭菌双蒸蒸水稀

50、释释使用A.6 溴化化乙锭（EEB）溶溶液溴化乙锭锭20 mmg灭菌双蒸蒸水加至200 mLLA.7 100加样缓缓冲液聚蔗糖25 gg灭菌双蒸蒸水100 mL溴酚蓝0.1 g二甲苯青青0.1 gA.8 DEEPC水水超纯水100 mL焦碳酸二二乙酯(DEPPC)50LL室温过夜夜，1221高压115miin，分分装到11.5 mL DEPPC处理理过的微微量管中中。A.9 M-MLVV 反转转录酶55反应缓缓冲液 1moLL Trris-HCll (ppH 88.3)5 mLLKCl0.5559 ggMgCll20.0229 ggDTT0.1554 gg灭菌双蒸蒸水加至1000 mmLA.1

51、00 22.5mmmoll/LddNTPPdATPP(100mmool/LL)20 LdTTPP(100mmool/LL)20 LdGTPP(100mmool/LL)20 LdCTPP(100mmool/LL)20 LA.111 110PCRR缓冲液液1M TTriss-HCCl (pH88.8) 10 mmL1M KKCl50 mmLNoniidett P4400.8 mL1.5mmoL MgCCl21 mLL灭菌双蒸蒸水加至1000 mmL附录B禽流感病病毒RTT-PCCR试验验用引物物B.1 反转转录引物物Uni 12:5-AGGCAAAAAGGCAGGG-33，引物物浓度为为20ppm

52、oll。B.2 PCCR引物物见下表，引引物浓度度均为220pmmol。B.2 PCCR过程程中选择择的引物物引物名称引物序列列长度(bp)扩增目的的M-2229U5-TTTCTTAACCCGAAGGTTCGAAAACC-3229通用引物物M-2229L5-AAAGCCGTCCTACCGCTTGCAAGTCCC-33H5-3380UU5-AAGTGGAATTTGGGAATTATGGGTAAACTTG-33380H5H5-3380LL5-AAACTTGAGGTGTTTCAATTTTTGTTCAAAT-33H7-5501UU5-AAATGGCACCARGGGAGGGAGGGAAACT-3501H7

53、H7-5501LL5-TTGAYYGCCCCCGGAAGGCTAAAACCCA-3H9-7732UU5-TTCAAACAAAACTTCCAACCGGAAAACTGGT-33732H9H9-7732LL5-TTCCCCGTAAAGAAACAATGTTCCAATACCCA-3N1-3358UU5-AATTRRAAAATACCAAYYGGYYATAAATAAAC-3358N1N1-3358LL5-GGTCWWCCGGAAAAACYYCCAACTGGCA-3N2-3377UU5-GGTGTTGYAATAGGCATTGGTTCCAAGCTTCAAAG-33377N2N2-3377LL5-GGAGCCCY

54、TTTCCCARTTTGTTCTCCTGCCA-33W = (ATT)；YY = (CTT)；RR = (AGG)。附件5禽流感病病毒致病病性测定定高致病性性禽流感感是指由由强毒引引起的感感染，感感染禽有有时可见见典型的的高致病病性禽流流感特征征，有时时则未见见任何临临床症状状而突然然死亡。所所有分离离到的高高致病性性病毒株株均为HH5或HH7亚型型，但大大多数HH5或HH7亚型型仍为弱弱毒株。评评价分离离株是否否为高致致病性或或者是潜潜在的高高致病性性毒株具具有重要要意义。1 欧盟盟国家对对高致病病性禽流流感病毒毒判定标标准接种6周周龄的SSPF鸡鸡，其IIVPII大于11.2的的或者核核苷

55、酸序序列在血血凝素裂裂解位点点处有一一系列的的连续碱碱性氨基基酸存在在的H55或H77亚型流流感病毒毒均判定定为高致致病性病病毒。静脉接种种指数（IIVPII）测定定方法：收获接种种病毒的的SPFF鸡胚的的感染性性尿囊液液，测定定其血凝凝价11/166（244或lgg24）将含含毒尿囊囊液用灭灭菌生理理盐水稀稀释100倍（切切忌使用用抗生素素），将将此稀释释病毒液液以0.1mLL/羽静静脉接种种10只只6周龄龄SPFF鸡,22只同样样鸡只接接种0.1mLL稀释液液作对照照（对照照鸡不应应发病，也也不计入入试验鸡鸡）。每每隔244小时检检查鸡群群一次，共共观察110天。根根据每只只鸡的症症状用数

56、数字方法法每天进进行记录录：正常常鸡记为为0，病病鸡记为为1，重重病鸡记记为2，死死鸡记为为3（病病鸡和重重病鸡的的判断主主要依据据临床症症状表现现。一般般而言，“病鸡”表现有下述一种症状，而“重病鸡”则表现下述多个症状，如呼吸症状、沉郁、腹泻、鸡冠和/或肉髯发绀、脸和/或头部肿胀、神经症状。死亡鸡在其死后的每次观察都记为3）。 IVPPI值每只鸡鸡在100天内所所有数字字之和/（100只鸡10天天），如如指数为为3.000，说说明所有有鸡244小时内内死亡；指数为为0.000，说说明100天观察察期内没没有鸡表表现临床床症状。当IVPPI值大大于1.2时，判判定分离离株为高高致病性性禽流感感

57、病毒（HHPAIIV）。IVPII测定举举例：(数字表表示在特特定日期期表现出出临床症症状的鸡鸡只数量量)临床症状1D2D3D4D5D6D7D8D9D10总计数值正常10100000000020 xx 0= 0发病00300000003 x 1= 3麻痹004510000010 xx 2= 200死亡00359101010101067 xx 3= 2001总计= 2224上述例例子中的的IVPPI为:2244/1000 = 2.241.222 OOIE对对高致病病性禽流流感病毒毒的分类类标准2.1 取HAA滴度1/116的无无菌感染染流感病病毒的鸡鸡胚尿囊囊液用等等渗生理理盐水11:100稀释，以以0.22mL羽的剂剂量翅静静脉接种种8只448周周龄SPPF鸡，在在接种110天内内，能导导致6只只或6只只以上鸡鸡死亡，判判定该毒毒株为高高致病性性禽流感感病毒株株。2.2 如分离离物