蛋白提取实验步骤
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文档编号:155711528
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1、蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞:离心收集细胞,每106细胞加250ulRIPA(在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),振荡。如果需要提高蛋白浓度,可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。b、加入适当体积的RIPA(使用前数分内加入蛋白酶抑制剂)于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶,使试剂与细胞充分接触。c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下,收集到1.5ml离心管中。C、冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。D、12000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。2、组织蛋白提取:A、
2、组织块用冷TBS洗涤2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度,可以适量减少该试剂体积。B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中,振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。C、12000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。1、组织尽可能新鲜,若不能及时提蛋白,组织标本应保存在-80C冰箱,并避免反复冻融。2、全程必须在冰上进行,避免蛋白降解。3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定,需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器(200U1)反复吹打,或再加入适量裂解液以保证充分裂解。5、总蛋白溶液不稳定(蛋白酶依旧有活性)可在-80C短时间保存,建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20C保存,避免反复冻融。
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