蔗糖合成酶的测定方法
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1、蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L,pH7.5)缓冲液,包括50mmol/LMgCI2;2mmol/LEDTA;0.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%间苯二酚:称取O.lg溶解并定溶于100ml95%乙醇中。30%盐酸、2mol/LNaOH、100mmol/LUDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉),洗净剪碎,置于预冷的研钵中,加3mlHepes-NaOH缓冲液,冰浴研磨,10000Xg离心10min。2、酶活性测定依次加入
2、50yL粗酶液,50卩LHepes-NaOH缓冲液pH7.5,20yL50mmol/LMgCI2,20gL100mmol/LUDPG,20gL100mmol/L6-磷酸果糖(20gL100mmol/L果糖),30C中反应30min后,加入200gL2mol/LNaOH终止反应,沸水煮10min,流水冷却,力口入1.5ml30%盐酸和0.5ml0.1%间苯二酚,摇匀后置于80C水浴保温10min,冷却后置于480nm处,以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。同时取50此粗酶液,加入200此2mol/LNaOH,以下同上操作,测定蔗糖含量。3、蔗糖标线制作:取0、40、80、120、160、20
3、0卩g/ml的蔗糖溶液50此,操作同上,然后以蔗糖浓度为纵坐标,以吸光值为横坐标,得方程。4、计算样品中酶活性(卩gg-1h-1)=式中C反应液催化产生的蔗糖总量(ug);V提取酶液时加入的缓冲液体积(ml);V2酶反应时加入的粗酶液体积(ml)淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液:0.1mol/L-l柠檬酸溶液(pH5.6);1%的淀粉溶液:用0.1mol/L-l的柠檬酸缓冲液(pH5.6)配制;标准麦芽糖溶液(lmg/mL-l);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中,移入1000mL容量瓶中,加入325mL2molL-1NaO
4、H溶液,再加入45g丙三醇,摇匀,冷却后定容到1000mL。淀粉和麦芽糖为Sigma产品,其余试剂为国产分析纯试剂。1.2测定方法1.2.1酶液的提取将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀,称取其果肉1g,置于预冷的研钵中,加2mL预冷的0.1mol/L-i柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨,将匀浆移入7mL的离心管中,再分别用ImL的O.lmol/L-1柠檬酸缓冲(pH5.6)冲洗2次,于4C下以15000Xg离心15min,上清液转移入另一个5mL离心管中,作为酶提取液备用。1.2.2酶活性的测定取洁净的试管18支,作标记,每一个样品设1个对照。总反应体积为0.5mL,测定管含0.2m
5、L的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液;对照管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6,不含底物淀粉)将试管放入恒温40C的水浴锅中,保温30min后取出,立即加入1.5mL的DNS试剂终止反应再将试管置于沸水浴中1Omin,取出后冰浴冷却。取反应液稀释10倍,测定波长520nm处的吸光值,同上做麦芽糖标准曲线,从标准曲线上查出麦芽糖的含量,计算淀粉酶的总活性。周蓓云.a-和B-淀粉酶活性的测定见:中国科学院上海植物生理研究所,上海市植物生理学会编.现代植物生理学实验指南.北京:科学出版社,1999.123124酸性转化酶活性的测定1. 酶的制备和活性测定
6、酶的制备参照Miron&schaffer(1991)以及王永章等(2。02)的方法,稍做修改。提取缓冲液为:150mmo1/1TrisHc1(pH8.0),10mmo1/1MgC1,10mmo1/1抗坏血酸,2mmo1/LEDTA一Na,1mmo1/LBenzadine(苯甲脒),0.1mmo1/LPMSF和0.2%(v/v)B疏基乙醇,视发育阶段不同加入3%(w/,)PvPP。称取一定量的果肉,加入2-3倍体积冷的提取缓冲液,于高速匀浆器中快速破碎组织至匀浆,16000*g离心20min,上清液对稀释10倍的提取缓冲液(不含PvPP)透析20h,其间更换透析液3次。经透析的上清液用于可溶性酸
7、性转化酶活性和数量的测定。离心得到的沉淀物用一定体积的提取缓冲液(不含PVPP)洗涤3遍,离心去上清液,沉淀用23倍体积的含0.5mo1/LNaCI的提取缓冲液充分悬浮后,低温(4C)下振荡浸提24h,16000*g离心20min,上清液透析后用于细胞壁酸性转化酶活性和数量的测定。透析方法同上。可溶性酸性转化酶和细胞壁转化酶活性的测定参照Miron&Schaffer(1991)的方法,测定反应液为0.1mo1/L乙酸一乙酸钠缓冲液(pH4.8),0.1mo1/L蔗糖。用3,5一二硝基水杨酸测定其生成还原糖的量。蔗糖合成酶的测定方法蔗糖是重要的光合产物,为植物体内运输的主要物质,又是碳水化合物的
8、暂贮形式之一。蔗糖合成酶(SS)、(SPS)是植物体内催化其合成的两种酶。这两种酶在生物体内的功能有所不同。蔗糖合成酶(SS)以游离果糖为受体,蔗糖磷酸合成酶(SPS)以果糖-6-磷酸为受体。后者形成的蔗糖磷酸,在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径,而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系统。UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供体,故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸化酶活力的高低与蔗糖合成的速率有十分密切的关系。蔗糖的合成(二条途径):1、蔗糖合成酶(非光合组织)UDPG+果糖一蔗糖+UDP2、磷酸蔗糖合成酶(光合组织)UDPG+F
9、-6-P-磷酸蔗糖+UDP磷酸蔗糖+H2O-蔗糖+Pi一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L,pH7.5)缓冲液,包括50mmol/LMgCI2;2mmol/LEDTA;0.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%间苯二酚:称取O.lg溶解并定溶于100ml95%乙醇中。30%盐酸、2mol/LNaOH、100mmol/LUDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉),洗净剪碎,置于预冷的研钵中,加3mlHepes-NaOH缓冲液,冰浴研磨,10000Xg离心
10、10min。2、酶活性测定依次加入50yL粗酶液,50卩LHepes-NaOH缓冲液pH7.5,20yL50mmol/LMgCI2,20gL100mmol/LUDPG,20gL100mmol/L6-磷酸果糖(20gL100mmol/L果糖),30C中反应30min后,加入200gL2mol/LNaOH终止反应,沸水煮10min,流水冷却,力口入1.5ml30%盐酸和0.5ml0.1%间苯二酚,摇匀后置于80C水浴保温10min,冷却后置于480nm处,以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。同时取50此粗酶液,加入200此2mol/LNaOH,以下同上操作,测定蔗糖含量。3、蔗糖标线制作:取0、40、80、120、160、200卩g/ml的蔗糖溶液50此,操作同上,然后以蔗糖浓度为纵坐标,以吸光值为横坐标,得方程。4、计算样品中酶活性(卩gg-1h-1)=式中C反应液催化产生的蔗糖总量(ug);V提取酶液时加入的缓冲液体积(ml);V2酶反应时加入的粗酶液体积(ml)
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