质粒DNA琼脂糖凝胶电泳

《质粒DNA琼脂糖凝胶电泳》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒DNA琼脂糖凝胶电泳（22页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、质粒质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳小组成员：杨松，祁平新，谭华发，礼小组成员：杨松，祁平新，谭华发，礼庄曾庄曾实验目的实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳检测掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原的原理和方法。理和方法。实验原理实验原理 DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为主要为分子筛效应。分子筛效应。在在 pH 值为值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带全部解离，核酸分子带负电，负电，在电泳时在电泳时向正极移动。向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在

2、采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛分子筛的作的作用下，使用下，使分子大小和构象不同的核酸分子分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入核酸分子中嵌入荧光染料（如荧光染料（如 EB）后，在紫外灯下可观后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。察到核酸片段所在的位置。实验器材和试剂实验器材和试剂 实验器材实验器材：制胶模具，水平式电泳槽，电泳仪，微量移液制胶模具，水平式电泳槽，电泳仪，微量移液器器,微波炉微波炉,紫外透射仪或凝胶成像系统。紫外透射仪或凝胶成像系统。样品

3、样品：DNA分子量标准品，质粒分子量标准品，质粒 试剂试剂 琼脂糖琼脂糖 1电泳缓冲液（电泳缓冲液（TBE）6上样缓冲液上样缓冲液 溴化乙锭溴化乙锭(EB)：10mg/ml 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定分离鉴定和和纯化纯化DNA片片段段的标准方法。的标准方法。该技术操作该技术操作简便快速简便快速，可以分辨用其它方，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。片段。当用低浓度的荧光嵌入染料当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色染色,在紫外光下至在紫外光下至

4、少可以检出少可以检出1-10ng的的DNA条带条带,从而可以确从而可以确定定DNA片段在凝胶中的位置。片段在凝胶中的位置。此外此外,还可以从电泳后的凝胶还可以从电泳后的凝胶中中回收特定的回收特定的DNA条带条带,用于以后的克隆操作。用于以后的克隆操作。天然琼脂（天然琼脂（agaragar）:又名琼胶、菜燕、冻粉又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。线状高聚物。琼脂糖（琼脂糖（agaroseagarose）琼脂胶（琼脂胶（agaropectinagaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸含硫酸根和羧基的强酸性多糖，性多糖，

5、在电场作用下能产生较强的电渗现象。在电场作用下能产生较强的电渗现象。琼脂琼脂(1)操作简单操作简单，电泳速度快，样品不需事先处电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶结构均匀结构均匀，对样品吸附极微，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖琼脂糖透明无紫外吸收透明无紫外吸收，电泳过程和结果，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。可直接用紫外监测及定量分析。(4)电泳后区带电泳后区带易染色易染色，样品易洗脱，便于定，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存量测定。制成干膜可长期保存

6、。影响琼脂糖凝胶电泳的因素影响琼脂糖凝胶电泳的因素 DNA分子的大小分子的大小：实验证明，实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量片段迁移距离与其分子量的对数成反比；的对数成反比；琼脂糖的浓度：琼脂糖的浓度：一定大小的一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；胶中，电泳迁移率不相同；DNA分子的构型：分子的构型：不同构型的不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。度差别较大。上样缓冲液 0.25溴酚兰；溴酚兰；0.25二甲苯青；二甲苯青；30甘油甘油水溶液水溶液 作用：作用：增加样品密度，使其比重增加，以确增加样品密度，使其

7、比重增加，以确保保DNA均匀沉入加样孔内均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置示带，可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色，使加样操作更方便使样品呈色，使加样操作更方便胶浓度（胶浓度（%）溴酚蓝溴酚蓝二甲苯青二甲苯青0.60.61kb1kb1 10.6kb0.6kb2kb2kb1.41.40.2kb0.2kb1.6kb1.6kb2 20.15kb0.15kb电泳指示剂：电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种核酸电泳常用的指示剂有两种 溴酚蓝（溴酚蓝（bromophenol blue,Bb）；）；二甲苯青（二甲苯青（xylene cya

8、nol,Xc），它携带的电荷量），它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂最常用的染色剂溴化乙锭溴化乙锭银染色银染色 溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的分子可嵌入核酸双链的碱碱基对基对之间，在之间，在紫外线紫外线激发下，发出激发下，发出桔红色桔红色荧光荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色染色

9、1015min EB染料有许多优点，如染料有许多优点，如染色操作简便、快速，染色操作简便、快速，灵敏度高，灵敏度高，10ng或更少的或更少的DNA即可检出即可检出。注意：注意：EBEB被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小操作时应尽量小心，配置和使用心，配置和使用EBEB时都应带上手套，且注意不要把时都应带上手套，且注意不要把EBEB洒到桌面或地板上。洒到桌面或地板上。银染色银染色 银染色液中的银离子银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色

10、。粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。脂糖凝胶染色。灵敏度比灵敏度比EB高高200倍，但银染色后，倍，但银染色后，DNA不宜不宜回收回收实验操作实验操作操作步骤1.准备准备用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子面上，并架好梳子2.配制配制1%琼脂糖凝胶及倒胶琼脂糖凝胶及倒胶具体步骤：具体步骤：三角瓶内：三角瓶内：1g琼脂糖琼脂糖+100ml(1TBE)煮胶溶解煮胶溶解 冷却至冷却至60(不烫手不烫手)加加EB 倒板倒板 室温下充分凝固室温下充分凝

11、固 垂直向上拔出梳子垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入向电泳槽中加入1xTBE缓缓冲液至刚没过凝胶表面。冲液至刚没过凝胶表面。3.加样加样 将将DNA样品（样品（5ul）与）与6 上样缓冲液（上样缓冲液（1ul）混匀混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。后，用微量加样枪小心加入样品孔内。注意加样枪的枪头注意加样枪的枪头不可插入过深不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。样品外溢。每加完一个样品要每加完一个样品要更换枪头更换枪头，以防止，以防止EB污染。污染。4.电泳电泳 接通电源，一般接通电源，一般红色为正极红色为正极，黑色为负极黑色为负极

12、，切记，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离（长度以两个电极之间的距离计算）计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳5.结果观察结果观察 电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。察电泳带及其位置，记录实验结果。注意事项注意事项1、倒胶时把握好胶的温度，不要高于倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太高会使制板变形；否则温度太高会使制板变形；2、胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔；竖直向上，不要弄坏点样孔；3、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶；不要刺穿凝胶；4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔；胶勿乱扔；5、紫外线照射不要太久。、紫外线照射不要太久。THE EDD谢谢谢谢