手性色谱分析

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1、2021/3/111 *手性药物分析的概念手性药物分析的概念 *常用手性高效液相色谱法常用手性高效液相色谱法 手性衍生化试剂法手性衍生化试剂法 手性固定相法手性固定相法 手性流动相添加法手性流动相添加法郑郑 枫枫 cpu_2021/3/112手性的概念：一种手性的概念：一种镜像反射镜像反射的对称性的对称性Mirror ImageMirror Image2021/3/113OHCOOHHCH3OHCOOHHCH32021/3/114手性异构体在药理学效应上的差异手性异构体在药理学效应上的差异 Pfeiffer规则：对映异构体之间的生物活性存在着差异；不同的对映体之间活性的差异是不同的；当手性药物

2、的有效剂量越低，即药效强度越高时，则对映体之间的药理作用的差别越大。外消旋体和其两种单一对映体是不同的外消旋体和其两种单一对映体是不同的3种实体！种实体！2021/3/115对映体与生物大分子的三点作用手性分子的手性分子的a、b、c三个三个基团与受体分子的活性作基团与受体分子的活性作用点用点、结合，是高结合，是高活性对映体（优映体）。活性对映体（优映体）。手性分子的手性分子的a、b、c三个基三个基团中只有团中只有a和和b与受体分子的与受体分子的活性作用点活性作用点 和和 结合，是结合，是低活性对映体（劣映体）。低活性对映体（劣映体）。cabdabdc 2021/3/116 两种单一对映体两种单

3、一对映体“反应停反应停”(Thalidomide)作为人工合成药，作为人工合成药，当时投入使用时是两种对映体的混合物。当时投入使用时是两种对映体的混合物。2021/3/117 反应停：反应停：五十年恩怨五十年恩怨2021/3/118手性药物的现状临床药物临床药物1850种种天然和半天然和半合成药物合成药物523种种化学合成化学合成药物药物1327种种非手性非手性6种种手性手性517种种非手性非手性799种种手性手性528种种以单个对映体以单个对映体给药给药509种种以外消旋体以外消旋体给药给药8种种以单个对映体以单个对映体给药给药61种种以外消旋体以外消旋体给药给药467种种2021/3/11

4、9发展趋势：劣映体本身或其代谢物产生毒副作用，不再使用外消旋体。外消旋体转换成单一对映体，不仅提高质量，还延长药物寿命。如：氧氟沙星的左旋异构体活性更强，如：氧氟沙星的左旋异构体活性更强，左旋氧氟沙星临床使用剂量是消旋体的左旋氧氟沙星临床使用剂量是消旋体的一半。一半。2021/3/1110 手性拆分（Chiral resolution）对映体除了偏振光的偏转方向不同外，其它理化性质完全相同，因而分离难度大。手性色谱拆分方法：创造（或引入）手性环境，构造非对映异构体非对映异构体，使药物对映体间呈现理化特性的差异，从而实现药物对映体的色谱分离。.2021/3/1111含多个手性碳原子化合物，分子中

5、所含手性碳含多个手性碳原子化合物，分子中所含手性碳越多，对映异构体的数目越多。越多，对映异构体的数目越多。B(R)A(S)A(R)B(S)A(R)B(R)A(S)B(S)对映体对映体非对映异构体非对映异构体2021/3/1112 手性高效液相色谱法手性高效液相色谱法（Chiral HPLC)手性衍生化试剂法（手性衍生化试剂法（CDR）（分析物）（分析物）手性固定相法（手性固定相法（CSP）（固定相）（固定相）手性流动相添加法（手性流动相添加法（CMP）（流动相）（流动相）2021/3/1113 手性试剂衍生化法（手性试剂衍生化法（CDR）原理：原理：光学活性光学活性药物药物与有与有高光学纯度高

6、光学纯度的手性试剂的手性试剂于柱前衍生化，在药物对映体中引入另外一个于柱前衍生化，在药物对映体中引入另外一个手性，手性，形成非对映异构体形成非对映异构体，再以，再以HPLC分析分析。(R)SA(R)SE(R)SA(R)SE(S)SA(R)SE(S)SA2021/3/1114 手性反应注意事项手性反应注意事项 手性试剂为高光学纯度试剂，光学稳定性好：手性试剂为高光学纯度试剂，光学稳定性好：异硫氰酸酯（异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（、异氰酸酯（IC）类：氨基酸）类：氨基酸 羧酸衍生物：胺类、醇类羧酸衍生物：胺类、醇类 胺类：羧基化合物。胺类：羧基化合物。手性待测物必须手性待测物必须具备反应活性基

7、团，具备反应活性基团，如胺基（如胺基（-NH2），），醇基（醇基（-OH），羧基（），羧基（-COOH），以保证与），以保证与CDR反应反应完全完全；生成的非对映体生成的非对映体光学稳定光学稳定，柱效要高柱效要高，能，能有效检测有效检测。2021/3/1115异硫氰酸酯（异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（）、异氰酸酯（IC）类）类 常用试剂有苯乙基异氰酸酯（PEIC）、2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC）。与大多数醇类醇类和胺类胺类化合物反应，形成相应氨基甲酸酯或脲的非对映异构体。广泛应用于氨基酸及其衍生物、麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等药物的分

8、离分析。2021/3/1116 在三乙胺存在条件下进行，于乙腈、二氯甲烷或DMF中进行。OAcOAcOOAcNCSOAcOAcOAcOOAcNHOAcCSNRNHRR1R2R2R12021/3/1117色谱分离和前处理条件优化（1）降低甲醇含量改善分离度，保留时间增加；（2）未衍生化的羧酸基对pH值比较敏感。（1）反应时间：10 min 30 min（2）用量：过量两倍 2021/3/1118手性拆分结果色谱条件：C18色谱柱，流动相：甲醇 1%三乙基乙二氨四乙酸TEAA 缓冲（pH=5.5），检测波长254 nm；1 ml/min。前处理：药物溶于含三乙胺乙腈水溶液，取50 l该溶液，加入5

9、0 l含2 g/L GITC的乙腈溶液，混合均匀后室温下放置10 min 30 min，进样分析。2021/3/11192021/3/11202021/3/1121 胺基类手性药物胺基类手性药物：运用异硫氰酸酯（：运用异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（）、异氰酸酯（IC）类、手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化为酰胺、氨基甲类、手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化为酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲和磺酰胺酸酯、脲、硫脲和磺酰胺。羧基类手性药物羧基类手性药物：运用手性胺类衍生化试剂，将其衍生化：运用手性胺类衍生化试剂，将其衍生化为酯和酰胺为酯和酰胺。醇类手性药物醇类手性药物：运用手性酰氯、磺酰氯类试剂：运用

10、手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生，将其衍生化成酯化成酯。烯类手性药物烯类手性药物：衍生化成水性铂复合物：衍生化成水性铂复合物。2021/3/1122手性固定相法（手性固定相法（CSP）原理：将手性试剂化学键合到原理：将手性试剂化学键合到固定相固定相上与药物上与药物对映体反应形成对映体反应形成暂时暂时的非对映体对复合物，这的非对映体对复合物，这种固定相称作种固定相称作CSP。在在CSP表面所形成的非对映体对，可根据其稳表面所形成的非对映体对，可根据其稳定常数不同而获得分离。（三点结合模型）定常数不同而获得分离。（三点结合模型）2021/3/1123对映体对映体和和手性固定相手性固定相之间，至少需

11、要之间，至少需要三个三个同时发同时发生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个必须是必须是立体化学立体化学相互作用。相互作用。手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相关的三点相互作用的关的三点相互作用的稳定状态稳定状态，而另一对映体则只，而另一对映体则只能两点作用形成不稳定状态。能两点作用形成不稳定状态。这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越大。大。“三点相互作用”Y Y为为S S性手性选择剂，性手性选择剂，X X为外消旋体为外消旋体2021/3/1124手性

12、固定相手性固定相吸附型吸附型电荷转移型电荷转移型蛋白质类蛋白质类环糊精类环糊精类多糖衍生物多糖衍生物 反相、防有机反相、防有机溶剂溶剂正相、防水正相、防水正、反相均可正、反相均可2021/3/1125蛋白质类手性固定相蛋白质类手性固定相 将蛋白质固定到硅胶上，利用蛋白质分子结构中的L-氨基酸提供手性作用位点与手性药物对映体产生不同的氢键作用、静电作用、疏水作用、离子对作用等达到手性拆分。常用流动相为磷酸盐缓冲液（pH 4 7），流动相中可加入不超过5%有机溶剂。2021/3/1126分类 白蛋白柱（白蛋白柱（HSA、BSA）糖蛋白柱：糖蛋白柱：1-酸糖蛋白柱酸糖蛋白柱（1-AGP）酶类2021

13、/3/11271-酸糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构体色谱柱为Chiral-AGP 柱（150 mm4.0 mm，5 m）柱温为25；流动相为50 mmol/L醋酸铵缓冲液（乙酸调pH至4.1），流速0.8 ml/min；检测波长为240 nm。2021/3/1128 纤维素的单体D-葡萄糖以-1,4-糖苷键相连而成的线型聚合物，将羟基衍生化 成酯以增强手性识别能力。由于水和卤代烃都能溶解纤维素及其衍生物，故流动相大都为使用极性较小的非卤代烃有机溶剂。多糖及其衍生物类手性固定相多糖及其衍生物类手性固定相O*OOHOHO*OHO*OHOHO*OHO*OHOHO*OHO*OHOHO*OH2021/3/

14、1129纤维素固定相手性识别作用纤维素固定相手性识别作用手性中心附近带有羰基的外消旋化合物与纤维素衍生物通过偶极偶极作用，带有羧基、羟基或氨基的外消旋化合物通过氢键发生手性识别作用。2021/3/1130 直链淀粉是D-葡萄糖以-1,4-糖苷键相连而成的线型聚合物，和纤维素的手性识别能力的不同，主要在于其葡萄糖单元的构象差异。2021/3/1131最常用的多糖型手性色谱柱（Daicel，大赛璐）淀粉柱：Chiralpak AD、Chiralpak AS、纤维素柱：Chiralcel OD、Chiralcel OJOROOROORnsilica-gel2021/3/11322021/3/1133

15、2021/3/1134 Chiralcel OD-H手性色谱柱（4.6 mm250 mm），流动相为正己烷异丙醇二乙胺（65 35 0.1）；流速为0.5 ml/min；紫外检测波长为259 nm；柱温为25；进样体积为20 l。2021/3/1135 环糊精类（包容环糊精类（包容色谱色谱）D-葡萄糖单元通过葡萄糖单元通过-1,4-糖苷键连接的环状糖苷键连接的环状分子结构分子结构，其疏水性内腔的，其疏水性内腔的包容作用包容作用和腔外上和腔外上的羟基与药物对映体的的羟基与药物对映体的氢键作用氢键作用是手性识别的是手性识别的基础。基础。有有、三种类型，其中三种类型，其中环糊精环糊精及其衍及其衍生物

16、应用范围最为广泛。生物应用范围最为广泛。2021/3/1136环糊精手性固定相改性 环糊精键合固定相机械强度差、不能在高压下使用，用氨基、氨基甲酸酯等改性，形成疏水相互作用或-相互作用、偶极偶极叠合作用，扩大了手性拆分的能力，又称多模式手性固定相（multimodal CSP，MMCSP）。2021/3/1137 将手性试剂加到将手性试剂加到流动相流动相中，利用下面两种方式中，利用下面两种方式实现拆分：实现拆分：流动相中手性试剂与对映体形成非对映体配流动相中手性试剂与对映体形成非对映体配合物，在固定相中的保留时间和分配不同而得合物，在固定相中的保留时间和分配不同而得到拆分；到拆分；手性试剂吸附

17、在柱上形成动态的手性固定相，手性试剂吸附在柱上形成动态的手性固定相，对映异构体与之作用不同而得到拆分。对映异构体与之作用不同而得到拆分。2021/3/1138 流动相添加环糊精法拆分时，与流动相中环糊精流动相添加环糊精法拆分时，与流动相中环糊精包合越好的对映体包合越好的对映体，随流动相，随流动相较快较快地被洗脱；地被洗脱；环糊精固定相拆分时，与固定相中环糊精环糊精固定相拆分时，与固定相中环糊精包合越包合越好的好的对映体易被固定相所保留，对映体易被固定相所保留，较慢较慢地被洗脱。地被洗脱。以环糊精流动相分离对映体的洗脱顺序与环糊精以环糊精流动相分离对映体的洗脱顺序与环糊精固定相拆分的顺序固定相拆

18、分的顺序刚好相反刚好相反。2021/3/1139影响分离的因素影响分离的因素 用量越少，保留时间越长，但是过高，则环糊精溶解度降低，显著影响对映体的分离度。pH值 酸度增大，有利于碱性药物的分离，对于酸性药物影响无规律性。2021/3/1140分子结构分子结构（）在其手性原子上均具有两个环状取代基或环内含有手性碳原子，而不能拆分的化合物在其手性碳原子上只含有一个环状取代基。（）空间效应对手性识别的影响更为显著。（）环糊精浓度增加有利于手性分离，但-环糊精溶解度受限制。2021/3/1141 H3CO*COOHCH3优化的流动相添加剂：(a)L-脯氨酸、(b)-环糊精（-CD）、(e)羟丙基-环

19、糊精（HP-CD）(c、d)甲基-环糊精（Me-CD）2021/3/1142 流动相体系：乙醇 水相（不同手性添加剂，1%三乙胺水溶液，pH为4.4）；HP-CD比甲基-CD拆分效果好 2021/3/1143色谱分离和前处理条件优化（1）相比于乙腈，乙醇可以使保留时间缩短；（2）随着乙醇体积分数的逐渐增大，其容量因子呈逐步减小的趋势，分离因子和分离度也减小。（1）随着HP-CD浓度的提高，容量因子迅速降低、分离因子增大。（2）过高时分离因子变化不大，使该条件下的流动相变浑浊。2021/3/1144 流动相pH值的优化 三乙胺含量的优化 柱温的优化 最佳色谱分离条件为：25 mol/L HP-C

20、D、15%乙醇、体积分数0.5%三乙胺、pH 3.5、柱温25。2021/3/1145手性离子对色谱法手性离子对色谱法 反离子(R)-B在流动相中处于未电离的形式，样品为酸性外消旋体(R)-HA和(S)-HA，流动相中就能形成低极性不解离的非对映异构体的“离子对”，可以在正相色谱柱上进行分离。用于氨基醇类和胺类药物分离。mmm(R)HA(R)B(R)HA(R)B(S)HA(R)B(S)HAss2021/3/1146 正相离子对色谱应用效果较好，常用固定相为硅胶、CN及Diol等。常用的手性反离子有：碱性：奎宁，奎尼丁、酸性：0-樟脑磺酸、N-苯酰氧基羰基-L-甘氨酸-L-脯氨酸。2021/3/

21、1147离子对色谱法分离普萘洛尔离子对色谱法分离普萘洛尔 色谱柱为二醇柱，Lichrospher 100-DIOL（250 mm4.0 mm），流动相为二氯甲烷 正戊醇（97 3，内含2.210-3 mol/L 樟脑磺酸），流速为0.3 ml/min；检测波长为225 nm。2021/3/1148配基交换型手性添加剂配基交换型手性添加剂 流动相缓冲溶液中加入金属离子（Cu2+，Zn2+，Ni2+）和配位体交换剂（L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，N-烷基-L-羟基脯氨酸）形成二元络合物，遇到药物消旋体形成稳定性不同的三元络合物。对喹诺酮类药物手性拆分有很好效果2021/3/1149 2021/3/1150其它手性色谱技术其它手性色谱技术 高效毛细管电泳（高效毛细管电泳（HPCE）毛细管电色谱（毛细管电色谱（CEC）个人观点供参考，欢迎讨论