《qPCR实验从设计primer开始到计算方法详例》由会员分享，可在线阅读，更多相关《qPCR实验从设计primer开始到计算方法详例（10页珍藏版）》请在装配图网上搜索。
1、.本人在日本留学虽然对于具体的原理不是特别理解，现把详细的实验real time PCR 的实验方法写出来让大家来参考。第一步： primer 设计Primer design:1. Find out the mRNA of related gene, for example: Mus musculus transgelin(Tagln) SM22a, mRNA s:/.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_011526.5NCBI Nucleotide GenBank2. open the website of Primer-Blast s:/.ncbi.nlm.nih.go
2、v/tools/primer-blast/1. Enter accession, gi, or FASTANCBI Reference Sequnece:NM_011526.5 , range2.3.Write the organism that you use for mice for homo sapiens, mice: Mus musculus (taxid:10090)Primer pair 1Sequence (5-3)Template strandLengthStartStopTmGC%Self plementaritySelf 3 plementarityForward pri
3、merGCTTTGGGCAGTTTGGCTGTPlus2063165062.0355.003.000.00Reverse primerTCTTATGCTCCTGGGCTTTCTTCAMinus2471869561.8645.833.001.00Product length88Exon junction698/699 (reverse primer) on templateNM_011526.53. 将设计的primer 序列交给公司合成就可以了。提取mRNA1. 对于组织，如血管。在冷的PBS液体中取出血管后马上放入液氮中。带全部样品提取完后，用粉碎机粉碎。大概20次/秒速度， 10秒每次，3
4、次。2. 加入1ml Trizon, 常温静止30min3. 放于冰上，加入200ul chloroform，震荡混匀。 13000rpm, 4，离心10-15min4. 取上清液，大概500-600ul5. 加入500ul 2-propronaol，震荡混匀，13000rpm, 4，离心10-15min。因小鼠组织太小，加入了4ul Dr.gene, precipitation6. 去掉液体，加入80%酒精500ul(一定要用无核酸酶的水， PCR 用水)，离心13000rpm, 4， 10-15min，重复操作2-3次。7. 去液体，干燥，加入PCR用水，溶解mRNA8. 测量RNA 含量
5、。9. 定量RNA含量，保证样品中有650ng/ul10. RT-RCR5*buffer 4uldNTP 8ulRadom primer 1ulRTace 0.5ulRPI 0.5ulmRNA: 6ul30， 10min； 42，60min；99， 5min；4，完成后稀释样品5倍保存待用。18s做参在保存用样品的基础上再稀释50倍。11. Real-time PCR 每个样品做1次重复SYBR qPCR mix: 7.5ulROX: 0.3ulPrimer F: 0.5025ulPrimer R: 0.5025ulDW 4.695 cDNA: 1.75 HOT start: 1min , 9
6、5 ， 1cycle； Amp.2 step: 15s, 95；45s， 60， 50cycle， Melt: 30s, 95。完成后， ROX 做为reference，导出Ct值最后结果Ct值计算方式例子如：得到的值为sampleTargetCtWT118s9.7WT218s9.84WT318s9.98KO118s9.73KO218s9.61KO318s9.52WT1actin31.95WT2actin32.83WT3actin33.69KO1actin34.07KO2actin34.59KO3actin41.611. 计算actin 18s值ctsampleactin-18sWT122.2
7、5WT222.99WT323.71KO124.34KO224.98KO332.09计算WT actin-18s的平均值WT actin-18s average22.98333(WT1,2,3 actin-18s 平均值)计算各样品减平均值得到值为ctsampleActin-18s-(WT actin-18s average)WT1-0.73333WT20.006667WT30.726667KO11.356667KO21.996667KO39.106667计算2 ctWT10.601513WT21.004632WT31.654811KO12.560928KO23.990769KO3551.2896计算平均值，算标准差即可此处KO3 肯定是个异常值，忽略不计的表格如下作 t-test， p=0.045-
qPCR实验从设计primer开始到计算方法详例
