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1、实验八：GFP在大肠杆菌中的诱导表达和检测,XIAMEN UNIVERSITY,宋 刚 2188275 厦门大学抗癌研究中心,一实验目的,掌握外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。 复习SDS-PAGE的制备及其分离原理。,二原核表达的一般流程,获得目的基因 准备表达载体 将目的基因插入表达载体中（测序验证） 转化表达宿主菌 诱导靶蛋白的表达 表达蛋白的分析 扩增、纯化、进一步检测,原核表达：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制； 用于细菌培养的材料
2、不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵； 有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。 但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。,三实验原理,表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： 选择标志的编码序列； 可控转录的启动子； 转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； 一个多限制酶切位点接头； 宿主体内自主复制的序列。,原核表达载体：,pET载体系统,本实验介绍一种常用的表达载体pET载体系统。 在pET系列载体中，外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚
3、合酶的调控，这类载体是Studier等于1990年首先构建的，后来得到很大发展。 带有pBR322的大肠菌素E1 (colEl)复制区。从而赋予宿主菌氨节青霉素或卡那霉素抗性。在这些载体中，编码序列在多克隆位点插入，置于天然T7 RNA聚合酶启动子(10启动子)或所谓的T7 lac启动子的控制之下，后者是带有lac操纵子( larO)序列的天然T7 RNA聚合酶启动子的衍生体。lac阻抑物的结合能阻断转录起始。,将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30a表达载体（如图1）中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录
4、与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达，表达蛋白可经SDS-PAGE检测。,SDS-PAGE分离蛋白原理,组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的pH值和离子强度。 聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,NN-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状结构中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电荷的多少
5、和蛋白质的大小和形状。根据迁移速率的不同，可将不同的蛋白质进行分离。,SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。,四实验材料
6、,五实验步骤,1目的蛋白的表达 （1）含外源基因的表达菌株在LB培养基（含50g/ml Kana）中预培养过夜 （2）按1/50的比例稀释菌液，于250r/min，培养3小时,使其OD600值达到0.6 （3）加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L （4）继续培养 小时 （5）取1.5ml菌液于10000r/min，离心2min，收获菌体,2目的蛋白的检测 （1）凝胶制备 分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约3040min后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。 （2）凝胶电泳 取80 ml 电极缓冲液稀释5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80V恒压20分钟，120V恒压2小时 （3）染色、脱色 电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色0.51 小时；之后，在脱色液中脱色1小时，观察目的蛋白表达情况。,五注意事项,1含外源基因的表达菌株应预培养之后再转接至培养瓶中，最好不要将菌种直接接于培养瓶培养，诱导表达。 2表达菌生长至OD600值0.6左右为诱导适合条件，避免菌生长过浓。 3配制SDS胶时应注意充分混匀后加入玻璃板中，并待其充分凝固后使用。,思考题,1原核表达目的蛋白的基本原理是什么？ 2SDS-PAGE电泳的原理是什么？,
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