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1、实验四 微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数,主要实验内容：,显微镜下细菌细胞大小的测定 血球计数板测定微生物细胞的数量 （显微镜下直接计数）,一 显微镜下细菌细胞大小的测定,1 实验目的 2 实验原理 3 实验材料 实验方法步骤 5 实验报告,1 实验目的,学习用镜台测微尺校正目镜测微尺的方法 学习并掌握用目镜测微尺测定细菌细胞大小 的方法 巩固显微镜油镜的使用方法,2 实验原理,测定微生物细胞大小是在显微镜下利用测微尺进行。测微尺可分为目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是特制的圆形玻片，中央有一刻度尺（100等分），可放入目镜镜筒内，用于测定细胞大小。镜台测微尺为一载玻片，上贴有圆形盖片
2、，中央有总长度为1mm(100等分)，每小格长0.01mm (10um) 。目镜测微尺每小格大小随显微镜放大倍数不同而改变，使用目镜测微尺进行测量之前必须用镜台测微尺标定，以求出在某一放大倍数下目镜测微尺每小格所代表的长度，然后用标定好的目镜测微尺进行测量。,3 实验材料,枯草杆菌标本片,4 实验方法步骤,（1）用镜台测微尺标定目镜测微尺。 （2）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小。,（1）用镜台测微尺标定目镜测微尺。,放置目尺：取出目镜，旋开接目镜，将目尺放在目镜镜筒的中间隔板上（有刻度的一面朝下），旋上接目镜，并插入镜筒。 放置台尺：将台尺放置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。 标定目尺：先用低
3、倍镜观察，找到台尺刻度，转动目镜使目尺与台尺的刻度轴线相平行，移动台尺使目尺与台尺某一区间的两对刻度线完全重合，然后计数出两重合线间各自所占格数，通过如下公式计算：,标定低倍镜目尺每小格所代表的实际长度,（2）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小,取下台尺，将染色片放在载物台上，先用低倍镜观察，后换油镜观测，计量细菌长和宽所占小格数，将测得格数乘以已标定的目尺每小格长，即得菌体实际大小。测定20个菌体求出平均值。,5 实验报告,（1） 目镜测微尺标定结果记录,（2） 在油镜下测量枯草杆菌大小结果记录,.,二 血球计数板测定微生物细胞的数量,1 实验目的 2 实验原理 3 实验材料 4 实验方法步骤 5
4、 实验报告,1 实验目的,掌握血球计数板测定微生物细胞数量的原理。 学习用血球计数板测定微生物细胞数量的方法。,2 实验原理,利用血球计数板在显微镜下直接计数，是将菌悬液放入血球计数板与盖玻片之间的计数室中，然后在显微镜下计数，因为计数室容积一定，所以可根据测定值推算出菌悬液单位体积所含微生物的总数量。,血球计数板的结构,它是特制的厚载玻片，中央区域有四条凹槽而形成三个平台，中间平台较宽，它又被一短横槽分隔为两部分，每一部分均有一个方格网，每一方格网可分为九个大方格，中央大方格就是计数室。大方格分为16个中方格，每个中方格又可分为25个小方格。每个大方格共含有400个小方格。计数室大方格边长为
5、1mm，底面积为1mm2，高0.1mm,所以每个计数室固定容积为0.1mm3。,计数方法,在计数时，用含16个中方格的计数板，要按对角线方位计数左上、左下、右上、右下等四个中方格（100个小方格）所含有的菌数；由此可计算得出每个小方格所含有的菌数的平均值， 计数室每个小方格容积为： 0.110-34001410-6(ml) 计算公式： 每ml菌液含菌数 = N K d (N：每个小方格含菌数平均值； d：菌液稀释倍数； K=4106),3 实验材料,稀释100倍的酵母菌菌悬液,即 d=100,实验方法步骤,1 镜检计数室：对计数室进行镜检，若内有污物，清洗后才能计数。 2 加样液：先在血球计数
6、板两个计数室部位加盖玻片，再用无菌玻棒或滴管沾取待测菌悬液稀释液（已摇匀），从盖玻片边缘滴加，使菌液沿缝隙靠毛细作用自行进入计数室内。静置5min。 3 显微镜计数：将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜观察，后换高倍镜观察计数。位于格线上菌体只计上边线和左边线上的，如果出芽酵母芽体大小达到母细胞一半时，可计作两个菌体。选择五个视野，在每个视野内任意选择五个小方格计数，求出每个小方格菌体数量平均值。 4 根据公式计算每ml菌液含菌数。 5 测量完毕后，取下盖玻片用水冲洗血球计数板（严禁用硬物刷洗），晾干，放入盒内保存。,注意事项 （1）取待测稀释菌悬液向血球计数板加样前，须将菌悬液充分摇匀。 （2）加样过程中，应避免将菌液滴在盖玻片 （3）由于菌体在计数室中处于不同空间位置，须在不同焦距下才能观察到，故观察时须不断调节微调，计数菌液中全部菌体，尽量避免遗漏。,实验报告,
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