蛋白质的修饰和表达.ppt

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1、二、蛋白质功能的全新设计,蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构和有用的功能。功能设计主要涉及键合及催化 为达到这些目的可以采用两条不同的途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质,蛋白质的功能设计,通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能 键合及催化的从头设计 在全新蛋白质中引入结合位点 催化活性蛋白质的设计 膜蛋白及离子通道的设计 新材料的设计,蛋白质修饰的化学途径 蛋白质修饰的分子生物学途径,第四章 蛋白质的修饰和表达,氨基的化学修饰,三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反应可区分-氨基和-氨基。完

2、全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持在水溶液中的可溶性。 -异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于-氨基。,羧基的化学修饰,由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可在较温和的条件进行,氧化和还原反应,二硫键的还原：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。 5，5二硫-2-硝基

3、苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态及跟踪构象变化的过程。,化学修饰影响的条件,1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件 2、pH值得变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。 3、温度：影响活性巯基的微环境 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。,化学方

4、法： 产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔合 非共价缔合 产生二硫键 形成肽键 产生非天然型的共价键,非共价缔合 在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链并不因此分开，仍能保持其生物学活性。在变性系统中，破坏非共价键后，在非变性基质中仍可形成原来的构型，活力也随之恢复。这一现象可用来产生半合成的类似物,产生二硫键 二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开 DTT、 二硫苏糖醇 将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌合分子,形成肽键 通过酶连接反应形成肽键 从猪胰岛素生产人胰岛素 将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白酶） 通过酶法与活性酯偶联

5、 羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子,产生非天然型共价键 利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子中的赖氨酸残基侧链相连接。 可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体 如：抗体 制备具有不同功能的F（ab)2的类似物,蛋白质改造的分子生物学方法 突变： 寡核苷酸介导的定向突变、 PCR方法、盒式突变 定向进化：异错PCR、基因家族改组技术 表达体系 原核表达：大肠杆菌 真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞,二、蛋白质改造的分子生物学途径,定位突变：在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片断 优点：突变率高、简单易行、重复性好 应用：研究基因的结构与功能

6、的关系；蛋白质结构与功能，读基因调控机理、疾病的病因和机理方面研究 应用：寡核苷酸介导的定点突变、PCR方法介导的定点突变及盒式突变 随机突变 优点：在体外模拟自然进化的过程 常用手段：易错PCR、基因家族改组技术（DNA family shuffling)等,寡核苷酸引物介导的定点突变,1、将待突变基因克隆到突变载体上 2、制备含突变基因的单链模板; 3、引物与模板退火，以5端磷酸化的突变寡核苷酸引物,与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA, 4、合成突变链:在DNA聚合酶的催化下,引物以单链DNA为模板合成全长的互补链,而后由连接酶封闭缺口,产生闭环的异源双链的DNA分子;

7、5、将异源双链DNA分子转化大肠杆菌后,产生野生型、突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学方法对突变基因进行筛选 6、对突变基因序列进行分析,寡核苷酸引物介导的定点突变的改进,缺点：产生突变效率低，原因：大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统 改进：KUNKEL用尿嘧啶取代DNA 特点:1、采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体 2、采用改进后的质粒，省去制备单链模板的步骤 3、增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多对敲除/修复引物，使质粒进行多次突变,U,U,U,U,U,U,3,5P,模板中尿嘧啶取代胸腺嘧啶,尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷菌株 ung- dUTP酶缺陷突变

8、体 dut-,转染ung+,模板链降解,Kunkel方法,寡核苷酸引物介导的定点突变的改进,关键技术步骤：制备高质量的含U的单链DNA模板 宿主：E.coli CJ 236品系,基于抗生素抗性“回复”的突变方法,多克隆位点,Tetr,Amps,Tetr,Amps,突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆,设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸,PCR方法介导的定点突变,通过改变引物中的某些碱基而改变基因序列，达到有目的改造蛋白质结构、研究蛋白质的结构和功能之间的关系的目的 取代突变、插入突变、缺失突变,5,3,5,3,5,3,5,3,盒式突变,盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片断

9、，取代野生型基因中的相应序列，设计成粘性末端 步骤： 1、将克隆片断用限制性内切酶切割 2、将合成的寡核苷酸片断与酶切后的克隆片断混合 3、产生突变基因产物,限制性内切酶,目标基因中要有适当的限制性内切酶位点： 利用遗传密码简并性 确保盒式突变序列的正确插入方向,3种方法优缺点比较,1、寡核苷酸引物介导的定点突变法 优点：保真度比PCR突变法高，改进后的突变成功率大大提高 缺点：操作过程复杂、周期长，待突变位点会受到限制性酶切位点限制 2、PCR方法 优点：操作简单，突变成功功率达100%。 缺点：后续工作复杂，要与载体相连；TaqDNA聚合酶保真性低，要分析学列 3、盒式突变 优点：简单、突

10、变效率高 缺点：合成多条引物的成本较高,蛋白质定向进化,1993年，美国科学家Arnold Fh 首先提出酶分子的定向进化的概念,易错PCR技术为代表的无性进化 DNA shuffling为代表的有性进化,定向进化技术,人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本蛋白质（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化蛋白质,定向进化的原理,易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于19

11、94 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年, Arnold 提出了一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术,随机突变的策略,易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变 连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变,易错PCR,DNA改组和外显子改组,DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR (sexu

12、al PCR)，原理如图所示,外显子改组(exon shuffling类似于DNA改组，与但与其不同，它是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。,体外随机引发重组,体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度,交错延伸,交错延伸(stagger extension pr

13、ocess, StEP) 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度,定向进化的筛选策略,突变体分离,琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动

14、系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定,通过酶促反应的特征 加入底物显色 荧光共振能量转移 同位素标记底物 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测,酶检测,信号探测,分光光度计和荧光酶标仪 气相色谱和高效液相色谱 质谱和核磁,定向进化与自然进化的异同点,定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同：,进化动力不同： 保守突变 非保守取代； 进化方向不同： 适应突变的积累； 进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白

15、质在顺序空间的可及性。,定向进化技术,Fig. 1. Publication rate of the directed evolution articles in biomedical literature between 1995 and 2004. The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database. The figure shows the total number of articles published each year, which co

16、ntain the key words directed evolution in their titles.,定向进化的应用,改进的易错PCR方法： MgCl2浓度增加到7mmol/L稳定非互补的碱基对； 加入0.5mmol/L MnCl2降低聚合酶的特异性； dCTP和dTTP的浓度增加到1mmol/L促进错误掺入； Taq DNA聚合酶量增加到5U以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续。,Figure 11 Strategy of the construction of the recombinant,Figure 12 Strategy of selection of the recom

17、binant plasmid,基因融合,避免外源蛋白的快速降解：小肽 使表达产物快速、有效的回收和纯化：分泌-亲和融合、双亲和融合法、分泌-插入融合法 定向分泌：信号肽 体外切割： 改变外源蛋白的溶解性，防止包涵体的形成：与硫氧化还原蛋白形成融合体 研究蛋白质结构功能,融合基因的构建的方法,PCR方法 蛋白质内含肽接到的蛋白质分子的连接 目标蛋白或蛋白片段用pCYB作为表达载体进行连接，产生目标蛋白-蛋白内含肽-甲壳素结合蛋白结构域的融合蛋白。此蛋白与苯硫酚及合成肽一起融合，形成融合肽,载体为pCYB,载体为pCYB,载体为pCYB ，形成 蛋白内含子-甲壳素结合 蛋白结构域的融合蛋白,tRN

18、A接到的非天然氨基酸掺入,4.1将目标蛋白质的基因重组入可用于体外转录的载体中 4.2 利用寡核苷酸介导的位点特异性突变，将特定氨基酸的密码子突变为无义密码（TAG） 4.3 利用run off转录或化学/酶法反密码子环取代法合成相应的校正tRNA，将氨基酸连接在校正tRNA上 4.4 通过体外转录体系，产生在特定位点突变成UAG的mRNA， 4.5 通过体外反以体系，将非天然氨基酸掺入到蛋白质分子中的特定位点,外源蛋白表达体系,原核表达体系：大肠杆菌 真核表达体系：酵母、昆虫、哺乳动物,原核表达体系,是外源基因表达的首选体系，只有在大肠杆菌中的表达产物由于不能正确折叠或缺少翻译后修饰而没有生

19、物活性，或当天然蛋白质的回收率太低时，才考虑选择其它表达体系。 优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，高密度发酵； 缺点： 没有真核转录后加工的功能 没有真核翻译后加工的功能 表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体,如何改善外源蛋白的溶解性？ 外源蛋白的分泌表达 细菌生长温度：改善在细胞质中表达蛋白溶解性的最简单方法是在诱导过程中降低工程菌的生长温度（降低到30度或更低）；通过用较弱的启动子减慢蛋白合成速率或利用部分诱导条件也可防止蛋白的错折叠和聚集，而使大量可溶蛋白积累。 外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达 外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合：如与硫氧环蛋白、His6标签等功表达可以

20、增加外源蛋白的溶解性。,酵母表达体系,表达载体：Yep（酵母附加体质粒）和YCp（酵母着丝点质粒），二者都含有促进在酵母中自主复制的序列，或ARS序列元件。是多拷贝质粒 甲醇酵母系统,外源蛋白质在酵母细胞中可以在蛋白质二硫键异构酶的作用下形成正确的二硫键。在酵母细胞中可以产生N-和O-连接的糖基化，从而糖组分与蛋白质分子共价相连。,哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。,哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染 病毒载

21、体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性,表达载体的表达,原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便

22、于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。目前采州的哺乳动物细胞表达戟体大都带有来自pBR322的衍生质粒如pX3、pBRd和pM的原核序列； 启动子和增强子； 剪接信号； 终止信号和poIyA加尾信号 遗传选择标记 ：胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶(dhr)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加,宿主细胞,常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等 CHO细胞则利于外源基因的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生产，是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%,降低外源多肽降解的策略 用蛋白酶缺失的菌株作为受体菌；形成融合体；改变生长条件：饥饿时可引起蛋白质周转率提高，低温降低蛋白水解，酸性条件抑制外泌蛋白降解（Ph5.5-6）。,