蛋白质分离技术层析2

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1、MatrixSpecific ligand固相化 再生无效洗脱吸附效率不高有效吸附 ：（2 2）葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺）葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺优点：优点：化学及物理性质稳定，可用强碱除去非化学及物理性质稳定，可用强碱除去非特异吸附杂质。特异吸附杂质。缺点：孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，缺点：孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低。可能会在与配体偶联时有较大的降低。因为因为Sepharose 4BSepharose 4B的结构比的结构比6B6B疏松，而吸附疏松，而吸附容量比容量比2B2B大，所以大，所以4B4B应用最广。应用最广。Ixv_2 JB 9809

2、1021低盐高盐分离结束带电荷洗脱树脂与树脂结合力胶体胶体阳离子交换基阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素（二）按载体种类不同二）按载体种类不同苯乙烯苯乙烯二乙烯苯二乙烯苯聚苯乙烯聚苯乙烯840 m可引入的解离基团可引入的解离基团+操作过程：操作过程：1.1.装柱；装柱；2.2.离子交换；离子交换；3.3.洗脱洗脱选用何种类型离子交换剂选用何种类型离子交换剂?-取决

3、于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择(三三)洗脱剂洗脱剂Hydrophobic interaction chromatography（HIC）疏水层析亦称疏水作用层析疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic(hydrophobic interaction chromatographyinteraction chromatography，HIC)HIC)，从分离纯化，从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸

4、附层析一类生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类 是一种通过表面疏水性的差异来分离蛋白质是一种通过表面疏水性的差异来分离蛋白质的柱层析方法的柱层析方法。一、疏水层析的原理一、疏水层析的原理 不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱顺序为Tyr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。（一）疏水作用（一）疏水作用蛋白质与固定相结合原理蛋白质与固定相结合原理蛋白质表面存在的疏水补丁蛋白质表面存在的疏水补丁蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分蛋白质发生（局部可逆性

5、）变性时，原本隐藏于分子内部的疏水残基暴露至分子表面子内部的疏水残基暴露至分子表面疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水残基容易与疏水性固定相结合面的疏水残基容易与疏水性固定相结合洗脱原理洗脱原理 通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐渐洗脱）渐洗脱）（二）吸附剂（二）吸

6、附剂根据基质的性质不同分为：根据基质的性质不同分为：1.1.亲水性吸附剂：亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖（糖（SepharoseSepharose）,配体有苯基和辛基化合物。二者配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成耦合而成特点：特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统不耐压，一般仅用于常压层析系统2.2.非亲水性吸附剂：非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合价键结合特点：特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，耐压，机械性能好。不仅

7、适用于常压层析，特别适用于高压层析（如特别适用于高压层析（如HPLCHPLC等）等）二、操作二、操作1.1.制备层析柱制备层析柱2.2.加样与洗脱加样与洗脱3.3.层析柱再生层析柱再生571.Equilibration2.Sample application3.Washing4.ElutionEquilibrate the column and adjust the sample to binding conditionsHydrophobic ligandGel matrixWater molecules581.Equilibration2.Sample application3.Washi

8、ng4.ElutionGel matrixProteinsHydrophobic groups 591.Equilibration2.Sample application3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-bound proteins601.Equilibration2.Sample application3.Washing4.ElutionTarget elutesConc.saltAbs61Conc.saltAbs1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.ElutionMore strongly bound

9、proteins偶联至基质的偶联至基质的常见配基类型常见配基类型（A A）丁基，）丁基，（B B）辛基，）辛基，（C C）苯基，）苯基，（D D）新戊基）新戊基 对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具具中等疏水的高分子配基中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚如聚乙二醇和聚丙二醇等丙二醇等)不仅可提供足够的结合力，且避不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。免了上述缺点。六、疏水层析的六、疏水层析的优点优点1、原则上可用于所有蛋白质纯化，处理量大，特别是从大体积样品中提取低含

10、量的目标蛋白显优势2、对DNA及小牛血清(其中的白蛋白、免疫球蛋白、氨基酸等成分)去除率较高，尤其是对细胞DNA一步去除率可达90以上3、一般放在纯化工艺的最前面。4、条件温和，不易使蛋白变性。5、可用于蛋白的浓缩。6、在纯化方案中，疏水作用层析可以用于样品的捕获、中度纯化、精细纯化。各种层析的效果对比：各种层析的效果对比：nIEC 离子交换层析nAC 亲和层析作业：作业：绘制某一蛋白的纯化流程图绘制某一蛋白的纯化流程图要求：要求：1、注明每一步的纯化条件和纯化、注明每一步的纯化条件和纯化方法。方法。2、必须包括粗分级分离和细分级、必须包括粗分级分离和细分级分离（层析）两个步骤。分离（层析）两个步骤。3、A4纸双面打印纸双面打印