植物组织培养与器官培养.ppt

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1、2020/8/12,1,第3章 植物组织与器官培养,植物组织培养：将离体的植物组织（器官、细胞、胚胎、原生质体）等在适当的培养条件，长成完整植株的技术。诱发产生愈伤组织、潜伏芽 植物器官培养： 将诱导的或植株 上原有的各种器官， 放在无菌的人工环境 中让其进一步发育， 最终长成幼苗或大量繁殖的过程。,植物离体无性繁殖,简称离体繁殖（in vitro propagation)、微型繁殖（micropropagation)，是指利用离体培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方法（技术）。 用这种方法得到的植株群体称单株无性

2、系。(来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同),近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛应用。,植物离体无性繁殖的意义（优越性）,繁殖速度快，经济效益高,占用空间小，不受地区季节限制，便于工厂化育苗,可以繁殖各种珍稀、涉危苗木,离体繁殖周期：13个月 繁殖系数：几十几百倍 又称快繁,离体繁殖是建立在体细胞系的基础上，是在人工控制的环境条件下，不会造成性状分离，也不会退化，同时还可避免病虫害的侵染。,利于筛选突变体，为育种服务,手指玫瑰,由根组织培养的蒲公英幼苗,植物离体无性繁殖的方式,器官发生型(organogenesis type) 胚状体发生型

3、(embryogenesis type) 不定芽型（adventitious bud type) 器官型(organ type) 原球茎型(protocorm type) 球茎芽型 块茎型 鳞茎型 孢子型 根茎型 微枝扦插型,器官发生型(organogenesis type)：,诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。 技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早期挑选，使其来源尽量一致。 特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。,芦荟、烟草、油菜等,2020/8/12,7,无菌母株制备,增殖、分化,植株再生及鉴定,炼苗和移植,培养基中激素

4、配比,激素种类及浓度,基本培养基组成,渗透压,逐步过渡,培养基筛选,材料灭菌,胚状体发生型(embryogenesis type)：,指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。 技术关键：提高不同外植体胚状体发生及萌发率和提高胚状体同步化率。 特点：胚状体发生数量多、速度快、结构完整，繁殖系数高；遗传性稳定。,甘蔗、胡萝卜、石刁柏等,不定芽型（adventitious bud type)：,选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生根形成植株的方式。 技术关键：打破顶端优势，促使

5、腋芽增殖并促其生根。 特点：繁殖率高、保持物种的遗传稳定性，多用于林木的繁殖。,FLash,器官型(organ type),指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎）产生再生成植株的方式。 技术关键：对培养基要求高，控制好激素浓度，避免愈伤组织发生。 优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。,三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等,原球茎型(protocorm type),兰属特有的方式，即外植体经培养产生原球茎，再直接长成植株。,球茎芽型,叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根,遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植,唐 菖 蒲,观 叶

6、 海 棠,块茎型,叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根 块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高 。 花叶芋,鳞茎型,鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 在试管内形成小鳞茎需较长时间 百合 郁金香,孢子型,用成熟或未成熟的孢子进行培养 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长 地钱,狼尾蕨,根茎型,蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快 肾蕨等,微枝扦插型,带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为木本植物进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树,2020/8/12,18,3.1.3 培养基,3.1.3.1 无机盐,无机盐,培养基

7、的组成,大量元素(使用浓度大于0.5mmol/L) 微量元素(使用浓度小于0.5mmol/L),2020/8/12,19,3.1.3.1 无机盐,2020/8/12,20,3.1.3.2有机物,氨基酸类 重要的有机氮源 维生素类 以辅酶形式参与植物细胞代谢活动，对生长、分化具有很好的促进作用 vb1， vb6 糖类 主要的碳源蔗糖？ 天然有机添加物类 CM（椰乳）、马铃薯汁、酵母提取液（YE）、番茄汁等,2020/8/12,21,蔗糖浓度分别为0、1%、5%,2020/8/12,22,3.1.3.3 调节物质,（一）生长素类 促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的细胞分

8、裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的产生等。 常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA IAA为天然植物生长素，见光易分解，高温高压易受破坏； 2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动脱分化阶段； 诱导分化则用NAA、NBA或IAA。IBA诱导生根效果最好。,2020/8/12,23,（二）细胞分裂素类 促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、抑制离体组织或器官衰老。 常用的有6-BA、 KT 、 ZT,6-BA,2020/8/12,24,BA分别为 0, 0.1, 5mg/L,NAA分别为 0, 0.1, 5mg/L,2020/8/1

9、2,25,（三）赤霉素类 主要应用GA3，促进体细胞胚发育成小植株，GA3不耐热，水溶解后不稳定，应采用过滤除菌，并用酒精溶解。 脱落酸 抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落。 乙烯,2020/8/12,26,3.1.3.4 植物细胞工程培养基配制,培养基母液的配制 大量元素一般配成10倍浓度的母液； 微量元素和有机营养常配成100倍浓度的母液； 混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以免沉淀； 生长调节类物质不溶于水,需用不同溶剂进行溶解 单独配制的试剂： 铁盐与EDTA CaCl2,前P28,2020/8/12,27,以KNO3为例,1L培养基需要量为

10、19g。,在配制母液时，增加10倍量，为190g。在母液中的浓度为190g/L，即0.19g/ml,在配制培养基时，取10ml，10ml0.19g/ml=19g,回P26,2020/8/12,28,3.1.3.4 植物细胞工程培养基配制,培养基配制过程 药品 按顺序混合 pH调整 加热溶解 器皿 水洗 干燥 分装培养基 加塞 冷却 高压蒸汽灭菌,2020/8/12,29,3.1.3.5 常用培养基,到目前研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方。但多数培养基配方是在几种普遍应用的培养基上演变而来的。 这几种常见的培养基为是：MS、ER、B5、N6、NT、White等

11、，其配方如下：,2020/8/12,30,2020/8/12,31,培养基分类,根据培养基无机盐含量的差异将其分为以下4类： 高无机盐含量培养基（植物器官、花药、细胞及原生质体培养）；-MS 较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5 中等无机盐含量培养基（花药培养）；-H 低无机盐含量培养基（生根）。-WHITE,2020/8/12,32,3.1.4 植物组织培养问题分析,3.1.4.1试管苗玻璃化现象（vitrification） 是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。 玻璃化苗绝大多数为 来自茎尖或茎段 培养

12、物的不定芽。 通常玻璃化苗 恢复正常的比例很低， 在继代培养中仍然 形成玻璃化苗。,2020/8/12,33,玻璃化的解决方法,增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势； 减少培养基中NH4+浓度； 增加光照； 增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用； 降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生； 降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。,2020/8/12,34,3.1.4.2 褐变问题,成因 酶促-酚氧化成醌及聚合 非酶促-醌聚合 时段 初代培养 继代培养,2020/8/12,35, 选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长

13、处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。 材料预处理和细胞筛选 使用吸附剂 0.1%-0.5%的活性炭、PVP对防止褐变也有较为明显的效果。 连续转移 对容易褐变的材料可间隔1224h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。,减轻褐变现象发生的方法,2020/8/12,36,3.1.4.3 微生物污染问题,原因 消毒不彻底 外植体消毒问

14、题 培养基及器皿消毒问题 环境消毒问题 无菌操作不过关,2020/8/12,37,外植体消毒问题,外植体取材 外植体(expant)是指用于离体培养的活的植物组织。 来源：,2020/8/12,38,外植体消毒问题,外植体灭菌的过程：流水冲洗1020min表面消毒无菌水冲洗45次 沥水待用 Flash,2020/8/12,39,常用消毒剂消毒灭菌效果比较,2020/8/12,40,培养基及器皿消毒灭菌问题,培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间,2020/8/12,41,培养基灭菌,培养基组成中若含有遇热易分解物质，如 生长调节物质、维生素、尿素、酶等，则必须用过滤法除菌。 过滤除菌时，使用孔径为0

15、.220.45m或更小的细菌滤膜。 过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应经过高压消毒灭菌，灭菌温度不超过121。,2020/8/12,42,器皿消毒灭菌,手术刀 镊子 平皿 干热灭菌 150-160，2h,2020/8/12,43,环境消毒问题,2020/8/12,44,无菌操作问题评价下列操作正确与否,2020/8/12,45,评价下列操作正确与否,2020/8/12,46,评价下列操作正确与否,2020/8/12,47,评价下列操作正确与否,2020/8/12,48,无菌操作,无菌操作前的准备工作 无菌操作台的使用 操作所用器械应浸泡在95%酒精中，用前需放在耐热器皿中加入

16、少量酒精后进行灼烧，每次使用后都要灭菌。 无菌操作步骤 外植体的适当切割的注意事项 继代培养的材料(液体材料、固体材料）,2020/8/12,49,3.1.4.4 其他问题,培养条件控制,激素水平 光照：时间，强度和光质。 温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在一定范围内降低培养温度可以使细胞的质量增加；培养基昼夜变温可能有利于器官的发生。 pH 通常使用的pH值的范围是5.56.5。pH7，培养物不能正常生长。 气体,2020/8/12,50,激素水平的控制,生长素应用的浓度范围为0.115mg/L。 在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组织，以2,4-D最为有效。 细胞脱分化需要高浓度的

17、2,4-D，当胚性细胞形成转入再分化时，则需较低的2,4-D浓度。 使用浓度范围为0.110mg/L。 细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细胞分化。,2020/8/12,51,16h/d,24h/d,0h/d,光照时间的影响,2020/8/12,52,液体振荡培养的愈伤组织生长与振荡频率的关系,2020/8/12,53,3.2 植物胚胎培养,Flash,2020/8/12,54,概念,花药培养属于 器官培养范畴,花粉培养属于 细胞培养范畴 也称小孢子培养,花药及花粉培养,把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成植株的过程,从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过培

18、养使其脱分化并发育成植株的过程,2020/8/12,55,获得单倍体植株 花药培养的基本程序： Flash 选处于生殖生长高峰期的花药，需低温预处理（310，210天），光照先弱后强。,花药培养目的及程序,2020/8/12,56,花粉或小孢子的分离,花粉或小孢子培养目的及方法,目的：获得单倍体植株,2020/8/12,57,花药看护培养 花粉悬浮培养 固液双层培养,花粉培养方法,2020/8/12,58,2020/8/12,59,3.3 毛状根培养,定义：毛状根(hairy roots)是（双子叶）植株或组织、器官经发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染后，形成的

19、类似头发一样的根组织。又称发状根。,1934年，Hildebrand 报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根 。,2020/8/12,60,毛状根的特性,特性： 毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。 生理生化和遗传稳定。 为什么可以不依赖激素？ 发根农杆菌的Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中。 T-DNA上有生长素合成基因tms 1 和tms 2能够指导IAA的合成。,2020/8/12,61,3.3.1 毛状根的诱导,3.3.1.1 外植体接种法 -共培养 3.3.1.2 茎秆接种法 3.3.1.3 原生质体-农杆菌共培养法,2020/8/12,62

20、,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,青蒿：为双子叶植物药菊科植物 青蒿素：,倍半萜内酯类化合物 功效：治疗疟疾,2020/8/12,63,1.Bioreactor, 2.Concentric draught cylinder, 3.Stainless stell mesh, 4.Air outlet, 5.Timer, 6.Mist nozzle, 7.Medium, 8.Air inlet, 9.Air filter, 10.Flowmeter, 11. Holes on draught cylinder, 12.Electromagnetic valve, 13.Air storage

21、tank, 14.Nebulizing device, 15. 40W fluorescent lamp,2020/8/12,64,2020/8/12,65,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,2020/8/12,66,Growth feature of Artemisia annua adventitious shoot in the mist bioreactor (a) 0 d ; (b) 10 d ;,10cm,30cm,2020/8/12,67,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,实验材料 青蒿毛状根： 由发根农杆菌R1601诱导青蒿叶片产生 培养方法及条件 1. 固体培养 2030

22、 mm青蒿毛状根根尖 MS固体培养基(添加30 L蔗糖) 继代时同为15d,2020/8/12,68,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,培养方法及条件 2. 液体振荡培养（三角瓶） 接种量：每L培养液（MS）5 g 毛状根培养物（分支多且细长的毛状根） 120-130 rpm，251 ，12 hd光照 液体培养的继代时间为10 d。 反应器培养 反应器中的培养液(MS)为400mL，接种量为0.8g 12 hd培养，25I 。 雾化间隔30 min，雾化2min。 通气量为0.5 Lmin，通气时间为15 mln。,2020/8/12,69,最大生物量10.3g/L，青蒿素产量达到179.1mg/L，青蒿素的含量为1.74。,2020/8/12,70,2020/8/12,71,小结,外植体选择是植物组织培养的基本环节，应根据不同培养目的确定取材原则。 通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？,