第六单元核酸2

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1、第第1212章章 核酸通论核酸通论第第1313章核酸的结构章核酸的结构第第1414章核酸的物理化学性质章核酸的物理化学性质第第1515章核酸的研究方法章核酸的研究方法1 1 核苷酸核苷酸2 2 核酸的共价结构核酸的共价结构3 DNA3 DNA的高级结构的高级结构4 RNA4 RNA的高级结构的高级结构主要元素组成：主要元素组成：C C、H H、O O、N N、P(911%)P(911%)与蛋白质比较，核酸一般不含与蛋白质比较，核酸一般不含S S，而，而P P的含量较的含量较为稳定，占为稳定，占9-11%9-11%。1 1 核苷酸核苷酸1.1 1.1 核酸的元素组成核酸的元素组成1.2 1.2

2、核酸的基本构成单位：核苷酸核酸的基本构成单位：核苷酸(nucleotide)(nucleotide)核苷酸由核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成三部分构成核酸与蛋白质一样，是核酸与蛋白质一样，是一种高分子聚合物。它一种高分子聚合物。它是由结构较简单的小分是由结构较简单的小分子有机化合物核苷酸子有机化合物核苷酸组成。组成。核苷酸核苷酸是核酸的是核酸的基本结构单位。基本结构单位。1.2.1 1.2.1 戊糖戊糖组成核酸的戊糖有两种。组成核酸的戊糖有两种。DNADNA所含的糖为所含的糖为-D-2-D-2-脱脱氧核糖；氧核糖；RNARNA所含的糖则为所含的糖则为-D-D-核糖。核糖。

3、OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖核酸中的戊糖核酸中的戊糖都是都是-D-D-型型嘌呤嘌呤(purine)(purine)NNNHN123456789NNNHNNH2腺嘌呤腺嘌呤(adenine,A)(adenine,A)NNHNHNNH2O鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,G)(guanine,G)1.2.2 1.2.2 碱碱 基基嘧啶嘧啶(pyrimidine)(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine,C)(cytosine,C)NNHNH2O尿嘧啶尿嘧啶(uracil,U)(uracil,U)NHNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thy

4、mine,T)(thymine,T)NHNHOOCH3NN132456酮式酮式烯醇烯醇式互式互变异变异构构大部分以酮式存在大部分以酮式存在 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。1.2.3 1.2.3 核苷核苷(ribonucleoside)(ribonucleoside)核苷核苷=戊糖戊糖+碱基碱基糖与碱基之间的糖与碱基之间的C-NC-N键，称为键，称为C-NC-N糖苷键糖苷键碱基和核糖通过碱基和核糖通过糖苷键糖苷键连接形成核糖核苷。连接形成核糖核苷。碱基和脱氧核

5、糖通过碱基和脱氧核糖通过糖苷键糖苷键连接形成脱氧核苷。连接形成脱氧核苷。核苷中戊糖与碱基的连接方式：核苷中戊糖与碱基的连接方式：嘌嘌 呤呤 嘧嘧 啶啶 核糖核糖 脱氧核糖脱氧核糖嘧啶碱：嘧啶碱：C1-N1C1-N1嘌呤碱：嘌呤碱：C1-N9C1-N9，POOOHOHOCH2OHOHNNNH2OOHOCH2OHOHNNNH2O核糖核苷酸：核糖核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMPAMP,GMP,UMP,CMP脱氧核糖核苷酸：脱氧核糖核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP dAMP,dGMP,dTMP,dCMP 1.2.4 1.2.4 核苷酸核苷酸(ribonucleotide)(ribo

6、nucleotide)的结构与命名的结构与命名核苷核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。核苷酸核苷酸=核苷核苷+磷酸磷酸 =戊糖戊糖+碱基碱基+磷酸磷酸BaseBase2-2-核糖核苷酸核糖核苷酸3-3-核糖核苷酸核糖核苷酸5-5-核糖核苷酸核糖核苷酸3-3-脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸5-5-脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸核糖核苷核糖核苷脱氧核糖核苷脱氧核糖核苷酸酸酸酸游离核苷酸多为游离核苷酸多为5-5-核苷酸核苷酸O-POO-NNNNN H2OHHO HHO HHO C H2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(A

7、TP)AMPADPATP5 5-NMP-NMP5 5-NDP-NDP 5 5-NTP-NTPN=AN=A、G G、C C、U U5 5-dNMP-dNMP5 5-dNDP-dNDP5 5-dNTP-dNTP N=A A、G G、C C、T T1.2.5 1.2.5 核苷酸衍生物核苷酸衍生物(1)ATP(1)ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸腺嘌呤核糖核苷三磷酸)n含有两个高能磷酸键。含有两个高能磷酸键。ATPATP水解可以释放出大量自由能。水解可以释放出大量自由能。n解释的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。能量转换中间体解释的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。能量转换中间体nATPATP

8、也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化的底物分子具有较高的能量也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。adenosine(2)GTP(2)GTP(鸟嘌呤核糖核苷三磷酸鸟嘌呤核糖核苷三磷酸)也是一种高能化合物。也是一种高能化合物。GTPGTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下况下,ATP,ATP 和和 GTP GTP 可以相互转换。可以相互转换。(3)cAMP(3)cAMP 和和 cGMPcGMPcAMP(3,5-cAMP(3,5-环腺苷酸环腺苷酸)

9、和和 cGMP(3,5-cGMP(3,5-环鸟苷酸环鸟苷酸)的主的主要功能是作为细胞之间传递信要功能是作为细胞之间传递信息的信使。息的信使。(4)(4)辅酶辅酶 维生素维生素PP-尼克酰胺辅酶（辅酶尼克酰胺辅酶（辅酶I）维生素维生素B2-黄素辅酶黄素辅酶2 2 核酸的共价结构核酸的共价结构2.1 2.1 核酸中核苷酸的连接方式核酸中核苷酸的连接方式2.2 DNA2.2 DNA的一级结构的一级结构2.3 DNA2.3 DNA与基因组与基因组5 端端3 端端2.1.1 2.1.1 核酸中核苷酸的核酸中核苷酸的连接方式连接方式核苷酸之间以核苷酸之间以磷酸二酯键磷酸二酯键连接形连接形成多核苷酸链，即成

10、多核苷酸链，即核酸。核酸。CGA55335 5 5 5 3 3 3 3 3 3 -5 -5 磷酸二酯键磷酸二酯键2.1.2 2.1.2 多聚核苷酸的特点多聚核苷酸的特点在多聚核苷酸的连接方式通常称为在多聚核苷酸的连接方式通常称为3 3-5-5 磷酸二酯磷酸二酯键键多聚核苷酸链一端的多聚核苷酸链一端的C C5 5带有一个自由磷酸基，带有一个自由磷酸基，称为称为5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5-P5-P表示）；另一端表示）；另一端C C3 3带有自由的羟基，称为带有自由的羟基，称为3-3-羟基端（常用羟基端（常用3-OH3-OH表示）。表示）。多聚核苷酸链具有多聚核苷酸链具有方向性方向性，当表示

11、一个多聚核苷，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是酸链时，必须注明它的方向是53(53(由左由左至右至右)或是或是3535。由核糖由核糖核苷酸核苷酸聚合而聚合而成的称成的称为为RNARNA；由脱氧由脱氧核糖核核糖核苷酸聚苷酸聚合而成合而成的称为的称为DNADNA。5 3 OHOHOH5 3 RNADNAHow polynucleotides How polynucleotides are actually formedare actually formed3 3-OH5-dNTP在多聚核苷酸（在多聚核苷酸（DNADNA或或RNARNA）链中，由于构成核苷酸）链中，由于构成核苷酸单元的戊

12、糖和磷酸基是相同的，体现核苷酸差别的单元的戊糖和磷酸基是相同的，体现核苷酸差别的实际上只是它所带的碱基，所以多聚核苷酸链结构实际上只是它所带的碱基，所以多聚核苷酸链结构也可表示为：也可表示为：T53 2.1.3 2.1.3 核酸的表示方式核酸的表示方式333555 竖线代表戊糖碳链，竖线代表戊糖碳链，P代表磷酸集团，与代表磷酸集团，与P相连的斜线带代表相连的斜线带代表3 3-5-5 磷酸二酯键磷酸二酯键A G P5 P T PG PC PT P OH 3 5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 P P为磷酸基团为磷酸基团5 5 3 3 结构式结构式5 5 3 3

13、 p p p p p p p pOHOH3 3 A AC CT TG G1 1 线条式线条式5 5 ACTGCATAGCTCGA ACTGCATAGCTCGA 3 3 字母式字母式DNADNA分子中各脱氧核苷酸分子中各脱氧核苷酸之间的连接方式（之间的连接方式（3 3-5-5 磷酸二酯键）和排列顺磷酸二酯键）和排列顺序叫做序叫做DNADNA的的一级结构一级结构，简称为碱基序列简称为碱基序列.5 3 DNADNA是是dAMPdAMP、dGMPdGMP、dCMPdCMP、dTMPdTMP连接起来的线形或连接起来的线形或环形多聚体。环形多聚体。连接键：连接键：3-53-5磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸与戊糖

14、顺序相连形成主链骨架磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架碱基形成侧链碱基形成侧链走向规定为走向规定为5-35-3DNADNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于生物界物种的多样性即寓于DNADNA分子中四种核苷酸千分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。变万化的不同排列组合之中。基因基因（genegene）：）：生物细胞中生物细胞中DNADNA分子的最小功能单位。分子的最小功能单位。蛋白质（蛋白质（mRNA mRNA 蛋白质）蛋白质）产物产物 tRNA tRNA RNA RNA rRNA rRNA 调节功能：调节基因调节功能

15、：调节基因无产物无产物 作用未知作用未知结构基因结构基因2.3.1 DNA2.3.1 DNA与基因与基因2.3 DNA2.3 DNA与基因组与基因组DNADNA的基本功能是以的基本功能是以基因基因的形式荷载遗传信息，的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。物质基础，也是个体生命活动的信息基础。基因组基因组（genomegenome）：某生物体所含全部基因。）：某生物体所含全部基因。Genome size 2.3.2 2.3.2 原核生物基因组的特点原核生物基因组的特点（1 1）DNADNA大部

16、分为大部分为结构基因结构基因，每个基因出现频率低。，每个基因出现频率低。（2 2）有）有基因重叠基因重叠现象。现象。ADF FE EB BExpression of a bacterial operon.In this example,an mRNA encodes more than one peptide.Such mRNA is called polycistronic.Some bacterial mRNAs are polycistronic,but nearly all eukaryotic mRNAs are monocistronic(encodes a single pept

17、ide).（3 3）功能相关基）功能相关基因串联在一起，并因串联在一起，并转录在同一转录在同一mRNAmRNA中中（多顺反子）。（多顺反子）。（1 1）重复序列）重复序列单拷贝序列单拷贝序列：在整个：在整个DNADNA中只出现一次或中只出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质少数几次，主要为编码蛋白质的结构基因。的结构基因。中度重复序列中度重复序列：在：在DNADNA中可重复几十次到中可重复几十次到几千次。几千次。高度重复序列高度重复序列：可重复几百万次：可重复几百万次高度重复序列一般富含高度重复序列一般富含A-TA-T或或G-CG-C，富含，富含A-TA-T的在密度梯度离心时在离心管中形成的区带

18、的在密度梯度离心时在离心管中形成的区带比主体比主体DNADNA更靠近管口；富含更靠近管口；富含G-CG-C的更靠近管的更靠近管底，称为卫星底，称为卫星DNADNA（satellite DNAsatellite DNA）富含富含A-TA-T富含富含G-CG-C主体主体DNADNA2.3.3 2.3.3 真核生物基因组的特点真核生物基因组的特点（2 2）有断裂基因有断裂基因 由于基因中由于基因中内含子内含子的存在的存在内含子内含子（intron)intron)：基因中不为多肽编码，不在：基因中不为多肽编码，不在mRNAmRNA中出现。中出现。外显子外显子（exonsexons）：为多肽编码的基因片

19、段。）：为多肽编码的基因片段。例外例外：组蛋白基因：组蛋白基因(histongene)(histongene)和干扰素基因和干扰素基因(interferon(interferon gene)gene)没有内含子。没有内含子。3 DNA3 DNA的高级结构的高级结构3.1 DNA3.1 DNA的二级结构的二级结构3.2 DNA3.2 DNA的三级结构的三级结构3.3 DNA3.3 DNA与蛋白质复合物的结构与蛋白质复合物的结构1)DNA1)DNA碱基组成分析碱基组成分析 2020世纪世纪4040年代年代chargaffchargaff规则规则 DNA DNA碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官

20、特异性。碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。A=T A=T；G=CG=C；A+C=T+G;A+G=T+C;A+C=T+G;A+G=T+C;3.1.1 3.1.1 提出提出DNADNA双螺旋结构模型的根据双螺旋结构模型的根据 3.1 DNA3.1 DNA的二级结构的二级结构-NH2-C=O嘌呤嘧啶碱基的理化数据分析碱基的理化数据分析,计算出计算出A-TA-T、G-CG-C以氢键配对以氢键配对较合理。较合理。Pauling Pauling 和和CoreyCorey发现发现A A与与T T生成生成2 2个氢键、个氢键、C C与与G G生成生成3 3个氢键。个氢键。2)DNA2)DNA的的N

21、aNa盐纤维和盐纤维和DNADNA晶体的晶体的X X光衍射分析光衍射分析（FranklinFranklin）3)3)已知核酸的化学结构：已知核酸的化学结构：磷酸、戊糖、含氮碱基磷酸、戊糖、含氮碱基3.1.23.1.2 DNA DNA的二级结构的发现的二级结构的发现19531953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick根据根据Chargaff Chargaff 规律和规律和DNA DNA NaNa盐纤维的盐纤维的X X光衍射分析提出了光衍射分析提出了DNADNA的双螺旋结构的双螺旋结构模型。模型。3.1.3 DNA3.1.3 DNA双螺旋结构的特点双螺旋结构的特点DNADNA分

22、子由两条分子由两条DNADNA单链组单链组成。成。DNADNA的双螺旋结构是分子的双螺旋结构是分子中两条中两条DNADNA单链之间基单链之间基团相互识别和作用的结团相互识别和作用的结果。果。双螺旋结构是双螺旋结构是DNADNA二级结二级结构的最基本形式。构的最基本形式。DNADNA的双螺旋模型特点的双螺旋模型特点（1 1）两条反向）两条反向平 行 的 多 聚平 行 的 多 聚核 苷 酸 链 沿核 苷 酸 链 沿一 个 假 设 的一 个 假 设 的中 心 轴 右 旋中 心 轴 右 旋相 互 盘 绕 而相 互 盘 绕 而形 成。螺 旋形 成。螺 旋表 面 有 大 沟表 面 有 大 沟和小沟。和小沟

23、。大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间,而大沟位于相毗邻的双股之间。而大沟位于相毗邻的双股之间。大沟大沟小沟小沟（2 2）磷酸和脱氧核）磷酸和脱氧核糖单位作为不变的糖单位作为不变的骨架组成位于外侧，骨架组成位于外侧，糖环平面与纵轴平糖环平面与纵轴平行；作为可变成分行；作为可变成分的碱基位于内侧，的碱基位于内侧，碱基平面与纵轴垂碱基平面与纵轴垂直。链 间 碱 基 按直。链 间 碱 基 按ATAT，GCGC配对配对（碱基配对原则，（碱基配对原则，ChargaffChargaf

24、f定律）定律）DNADNA的双螺旋模型特点的双螺旋模型特点（3 3）螺旋横截面的）螺旋横截面的直径约为直径约为2nm2nm，每，每条链相邻两个碱条链相邻两个碱基平面之间的距基平面之间的距离为离为0.34 nm0.34 nm，螺，螺旋结构每隔旋结构每隔1010个个碱基对（碱基对（base base pair,bppair,bp）形成）形成一个螺旋，其螺一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转矩（即螺旋旋转一圈的高度）为一圈的高度）为3.4 nm3.4 nm。DNADNA的双螺旋模型特点的双螺旋模型特点2.0 nm小小沟沟大大沟沟（4 4）维持两条）维持两条DNADNA链链相互结合（横向）相互结合（横向）的力

25、是链间碱基对的力是链间碱基对形成的形成的氢键氢键。A A和和T T之间形成两个氢键，之间形成两个氢键，G G与与C C之间形成三个之间形成三个氢键。氢键。碱基堆积力维持双链碱基堆积力维持双链螺圈之间（纵向）螺圈之间（纵向）稳定性。稳定性。DNADNA的双螺旋模型特点的双螺旋模型特点TAGCDNADNA的双螺旋模型特点的双螺旋模型特点（5 5）碱基在一条链上的）碱基在一条链上的排列顺序不受限制，而排列顺序不受限制，而在另一条链上要遵循碱在另一条链上要遵循碱基配对原则，为第一条基配对原则，为第一条链的互补链。链的互补链。表明遗传信息有碱基序表明遗传信息有碱基序列携带。列携带。3.1.4 DNA3.

26、1.4 DNA双螺旋的种类双螺旋的种类 Watson Crick DNAWatson Crick DNA双螺旋结构（双螺旋结构（B B型型DNADNA）当当DNADNA钠盐纤维钠盐纤维相对湿度相对湿度和和盐的种类盐的种类改变时，改变时，DNADNA的构象发生改变。的构象发生改变。不同不同DNADNA纤维的空间结构纤维的空间结构 类型类型结晶状态结晶状态A ANaNa盐，相对湿度盐，相对湿度75%75%时结晶时结晶B BNaNa盐，相对湿度盐，相对湿度92%92%时结晶时结晶C C锂盐，相对湿度锂盐，相对湿度66%66%时结晶时结晶B-DNAB-DNA：92%92%相对湿度，接近细胞内的相对湿度

27、，接近细胞内的DNADNA构象，与构象，与Watson Watson 和和CrickCrick提出的模型相似。提出的模型相似。A-DNAA-DNA：75%75%相对湿度，与溶液中相对湿度，与溶液中DNA-RNADNA-RNA杂交分子的构象相杂交分子的构象相似，推测转录时发生似，推测转录时发生BABA。其碱基平面倾斜。其碱基平面倾斜2020，螺距与每，螺距与每一转碱基对数目都有变化。一转碱基对数目都有变化。Z-DNAZ-DNA：主链呈锯齿型左向盘绕，直径约：主链呈锯齿型左向盘绕，直径约1.8nm1.8nm，螺距，螺距4.5nm4.5nm，每一转含每一转含1212个个bpbp，只有小沟。，只有小沟

28、。B-DNAB-DNA与与Z-DNAZ-DNA的相互转换可能的相互转换可能和基因的调控有关。和基因的调控有关。Z-DNAZ-DNA为左手螺旋。为左手螺旋。C-DNAC-DNA：4446%4446%相对湿度，螺距相对湿度，螺距3.09nm3.09nm，每转螺旋，每转螺旋9.339.33个碱个碱基对，碱基对倾斜基对，碱基对倾斜6 6。可能是特定条件下。可能是特定条件下B-DNAB-DNA和和A-DNAA-DNA的转的转化中间物。化中间物。D-DNAD-DNA：60%60%相对湿度，相对湿度，DNADNA中中A A、T T序列交替的区域。每个螺旋序列交替的区域。每个螺旋含含8 8个个bpbp，螺距，

29、螺距2.43nm2.43nm，碱基平面倾斜，碱基平面倾斜1616。Comparison between B form and Z form双螺旋双螺旋DNADNA的结构参数的结构参数类型类型旋旋转转方方向向螺旋直径螺旋直径（nmnm）螺距螺距（nmnm）每转碱每转碱基对数基对数目目碱基对碱基对间垂直间垂直距离距离nmnm碱基对碱基对与水平与水平面倾角面倾角A ADNADNAB BDNADNAZ ZDNADNA右右右右左左2.32.32.02.01.81.82.82.83.43.44.54.51111101012120.2550.2550.340.340.370.3720200077DNADNA

30、变构效应可能与基因表达调控有关变构效应可能与基因表达调控有关DNADNA分子内的分子内的三链结构三链结构 多聚嘌呤多聚嘌呤多聚嘧啶多聚嘧啶DNADNA三链间的碱基三链间的碱基配对（配对（HoogsteenHoogsteen配对）配对）T-A-TT-A-TC-G-CC-G-CDNADNA三股螺旋三股螺旋-DNADNA三股螺旋结构常出现在三股螺旋结构常出现在DNADNA复制、转录、重组复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。的起始位点或调节位点，如启动子区。第三股链的存在可能使一些调控蛋白或第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNARNA聚合酶聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息

31、的等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。表达。碱基堆积力碱基堆积力（base stacking forcebase stacking force），由芳香族碱），由芳香族碱基基电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定稳定DNADNA最重要的因素；最重要的因素；碱基配对的碱基配对的氢键氢键。GCGC含量越多，越稳定。含量越多，越稳定。磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子（如（如Na+Na+、K+K+和和Mg2+Mg2+）或组蛋白的正离子之间形成或组蛋白的正离子之间形成离子键离子键，中和了，中和了磷酸基上的负电荷

32、间的斥力，有助于磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNADNA稳定。稳定。DNADNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。改变介质条双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。3.1.5 DNA3.1.5 DNA双螺旋的稳定性双螺旋的稳定性3.1.6 DNA3.1.6 DNA的双螺旋结构的意义的双螺旋结构的意义 该模型揭示了该模型揭示了DNADNA作为遗传物作为遗传物质的稳定性特征，最有价值质的稳定性特征，最有价值的是确认了的是确认了碱基配对碱基配对原则，原则，这是这是DNADNA复制、转录和反转录复制、转录和反转录的分子基础

33、，亦是遗传信息的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该传递和表达的分子基础。该模型的提出是模型的提出是2020世纪生命科世纪生命科学的重大突破之一，它奠定学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的至整个生命科学飞速发展的基石。基石。超螺旋超螺旋螺旋螺旋 三级结构是指三级结构是指DNADNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的特定构象。叠形成的特定构象。超螺旋超螺旋是是DNADNA三级结构的主三级结构的主要形式。要形式。3.2 DNA3.2 DNA的三级结构的三级结构1965年年Vinograd等用电镜发现

34、等用电镜发现SV40和多瘤病毒的环形和多瘤病毒的环形DNA的超螺旋。的超螺旋。Relaxed and supercoiled DNA molecules Relaxed and supercoiled DNA molecules 共价闭合环状共价闭合环状DNADNA 开环开环DNADNA 线型线型DNADNAL=25,T=25,W=0松弛环形松弛环形1152010523L=23,T=23,W=0解链环形解链环形15101520231510152025L=23,T=25,W=2负超螺旋负超螺旋121482316131510152023右手旋转拧松两匝后的线形右手旋转拧松两匝后的线形DNADNA超

35、螺旋的形成超螺旋的形成 超螺旋的方向超螺旋的方向The supercoils introduced by underwinding are called“negitive”,while the supercoils introduced by overwinding are called“positive”.天然环状天然环状DNA一般都以负超螺旋构象存在一般都以负超螺旋构象存在超螺旋：解除外力捻转造成的胁变超螺旋：解除外力捻转造成的胁变正超螺旋：在外力往紧缠的方向捻转时产生。正超螺旋：在外力往紧缠的方向捻转时产生。负超螺旋：在外力向松缠的方向捻转时产生。负超螺旋：在外力向松缠的方向捻转时产生。

36、使使DNADNA形成高度致密状态从而得以装入核中；形成高度致密状态从而得以装入核中；推动推动DNADNA结构的转化以满足功能上的需要。如负结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。变性，利于复制和转录。3.3 DNA3.3 DNA与蛋白质复合物的结构与蛋白质复合物的结构生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白（nucleoproteinnucleoprotein）的形式存在。）的形式存在。DNADNA分子十分巨大，与蛋白质结合后被组装

37、到有限的空间中。分子十分巨大，与蛋白质结合后被组装到有限的空间中。DNA长度（长度（m）细胞直径（细胞直径（m）病毒病毒 1.76511.311.3或或5.05.0）、）、变性剂（脲、甲酰胺、变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）、低离子强度、甲醛）、低离子强度、加热加热结构：螺旋结构：螺旋线团线团 理化性质：紫外吸收理化性质：紫外吸收 粘度粘度比旋光度比旋光度 生物活性：生物活性生物活性：生物活性或丧失或丧失 5.1.2 5.1.2 热变性和热变性和T Tm mn当当DNADNA的稀盐溶液加热到的稀盐溶液加热到80-10080-100时，双螺旋结构时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。

38、即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。80 90 80 90 100 100 100%100%50%50%ODOD260260（254254）TmTm 变性温度范围变性温度范围DNADNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。个很窄的温度范围内。融解温度融解温度（melting temperature,Tmmelting temperature,Tm）：）：DNADNA热变性过程中，热变性过程中，DNADNA的双螺旋结构失去一半时的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为该对应的温度称为该DNADNA得熔点或熔解温度（得熔点或熔解温度（TmTm）

39、60801001.01.41.2100%A260t 0CTmTmTmTmTmTm1 1）TmTm的大小与的大小与DNADNA分子中（分子中（G+CG+C）的百分含量成正相的百分含量成正相关，测定关，测定TmTm值可推值可推算核酸碱基组成及算核酸碱基组成及判断判断DNADNA纯度。纯度。经验式经验式:(G+C)%=(Tm-69.3)(G+C)%=(Tm-69.3)2.44 2.44 Poly d(A-T)DNAPoly d(G-C)某些某些DNA的的Tm值值5.1.3 5.1.3 影响影响TmTm的因素的因素3 3）介质中离子强度）介质中离子强度离子强度高，离子强度高，TmTm高。高。大肠杆菌大

40、肠杆菌DNADNA在不同浓度在不同浓度KClKCl溶液下的熔融温度曲线溶液下的熔融温度曲线2 2）DNADNA均一性均一性 均一性高，变性的温均一性高，变性的温度范围越窄，据此可度范围越窄，据此可分析分析DNADNA的均一性的均一性 。n变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为成为双螺旋结构的过程称为复性复性。5.2 5.2 复性复性5.2.1 5.2.1 复性过程复性过程 理化性质理化性质:比旋光度比旋光度 粘度粘度高于高于Tm值值5 复性复性 也称退火也称退火（annealing）缓缓慢慢冷冷却却迅迅速速冷冷却却生物活性得到部

41、分恢复，具有减色效应。生物活性得到部分恢复，具有减色效应。变性的变性的DNADNA缓慢缓慢冷却时可复性，因此又称为冷却时可复性，因此又称为“退火退火”5.2.2 5.2.2 影响复性速度的因素：影响复性速度的因素：（1 1）单链片段浓度）单链片段浓度（2 2）单链片段的大小）单链片段的大小（3 3）重复序列的多少）重复序列的多少（5 5）溶液温度的高低）溶液温度的高低T 25T 25（4 4）维持一定的溶液离子强度）维持一定的溶液离子强度5.3 5.3 核酸的杂交核酸的杂交在退火条件下，不同来源的在退火条件下，不同来源的DNADNA互补区形成双链，或互补区形成双链，或DNADNA单链和单链和R

42、NARNA链的互补区形成链的互补区形成DNA-RNADNA-RNA杂合双链的杂合双链的过程叫做过程叫做分子杂交分子杂交。DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子有碱基配对的区域有碱基配对的区域不同来源的不同来源的DNADNA单单链间或单链链间或单链DNADNA与与RNARNA之间只要有碱之间只要有碱基配对的区域，基配对的区域，在适宜的条件在适宜的条件（温度及离子强（温度及离子强度）下，在复性度）下，在复性时可形成局部双时可形成局部双螺旋区，就可以螺旋区，就可以在不同的分子间在不同的分子间形成杂化双链形成杂化双链探针：用放射性同位素或荧光标记的

43、探针：用放射性同位素或荧光标记的DNADNA或或RNARNA片段。片段。原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。核酸杂交，未改变核酸所在的位置。点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。SouthernSouthern印迹法：将电泳分离后的印迹法：将电泳分离后的DNADNA片段从凝胶片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。NorthernNorthern印迹法：将电泳分离后的印迹法：将电泳分离后的RNARNA吸印到纤维吸印到纤维素膜上再

44、进行分子杂交。素膜上再进行分子杂交。WesternWestern印迹法：将电泳分离后的蛋白吸印到纤维印迹法：将电泳分离后的蛋白吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。探针是抗体。素膜上再进行分子杂交。探针是抗体。核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用研究研究DNADNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾病诊断等病诊断等 http:/三篇重要论文 PC

45、R技术诞生所依赖的社会需求和研究需要20kB fragments插入噬菌体载体细菌扩增从基因组文库中筛选目的基因从基因组文库中筛选目的基因probe引物引物1977年引物引物引物引物1983年XX()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 复温 PCRPCR原理原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extensionPCR productPCR productPCR反应曲线反应曲线标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L

46、引物引物 10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ulPCRPCR反应五要素反应五要素引物（引物（primer）酶酶（Taq DNA polymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板模板（template）Mg2+（magnesium）引物引物引物是引物是PCR特异性反应的关键特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度互补的程度理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，序列，就

47、能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用用 PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量扩增在体外大量扩增引物设计的原则（一）引物设计的原则（一）引物长度：引物长度：15-30bp，常用为，常用为20mer左右左右引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超，否则最适延伸温度会超过过TaqDNA聚合酶的最适温度（聚合酶的最适温度（74），不能保证），不能保证PCR扩扩增产物的特异性增产物的特异性引物扩增跨度：引物扩增跨度：以以500bp为宜为宜特定条件下可扩增长至特定条件下可扩增长至10kb的片段的片段引物碱基：引物碱基：G+C

48、含量以含量以40-60%为宜为宜G+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列串排列引物设计的原则（二）引物设计的原则（二）避免引物内部出现二级结构避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，避免两条引物间互补，特别是特别是 3端的互补，否则会形成引端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带物二聚体，产生非特异性的扩增条带引物引物 3端的碱基要求严格配对端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对特别是最

49、末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致而导致PCR失败失败引物中有或能加上合适的酶切位点引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处分子克隆很有好处引物设计的原则（三）引物设计的原则（三）引物的特异性：引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物量：引物量：每条引物的浓度每条引物的浓度0.1 1umol或或10 100 pmol，以最低引物，以最低引物量产生所需要的结果为好量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特

50、异性扩增，且可增加引物引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会之间形成二聚体的机会引物设计的原则（四）引物设计的原则（四）RT-PCR 引物设计特别注意：引物设计特别注意：跨越两个外显子跨越两个外显子酶及其浓度酶及其浓度目前有两种目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成基因工程酶：大肠菌合成一个典型的一个典型的 PCR反应约需酶量反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为（指总反应体积为100 ul时）时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量浓度过高可引起非特异性扩增，浓

51、度过低则合成产物量减少减少dNTP 的质量与浓度的质量与浓度dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系扩增效率有密切关系dNTP呈颗粒状，呈颗粒状，保存不当易变性失活保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或或1M Tris-HCl的缓冲液将其的缓冲液将其pH调节到调节到7.07.5，小量分装，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解降解在在PCR反应中，反应中，dNTP应为应为50200umol/L，尤其是注意，尤其是注意4种种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相

52、等（等摩尔配制），），如其中任何一种如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低浓度过低又会降低PCR产物的产量产物的产量dNTP 能与能与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度降低浓度降低模板（靶基因，模板（靶基因，target genetarget gene）模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之成败与否的关键环节之一一传统的传统的DNA纯化方法通常采用纯化方法通常采用SDS和蛋白酶和蛋白酶K 来消化处理来消化处理标本标本SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上

53、的脂类与蛋白质，因而的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀还能与蛋白质结合而沉淀蛋白酶蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸乙醇或异丙醇沉淀核酸模板（靶基因，模板（靶基因，target genetarget gene）提取的核酸即可作为模板用于提取的核酸即可作为模板用于PCR反应反应一般临床检

54、测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于直接用于PCR扩增扩增RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止法，要防止RNase降解降解RNAMgMg2+2+浓度浓度Mg2+对对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的在一般的 PCR反应中，各种反应中，各种NTP浓度为浓度为200umol/L时，时，Mg2+浓度为浓度为1.52.0 mmol/L为宜为宜Mg2+浓度过高，反

55、应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓浓度过低会降低度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减聚合酶的活性，使反应产物减少少PCRPCR反应条件的选择反应条件的选择PCR反应条件反应条件:温度温度时间时间循环次数循环次数温度与时间的设置温度与时间的设置：设置变性设置变性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链标准反应中采用三温度点法，双链DNA在在9095变性，变性，再迅速冷却至再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至然后快速升温至7075，在，在Taq DNA 聚合

56、酶的作用聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度时）可采用二温度点法，点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变变性，性，65左右退火与延伸左右退火与延伸 变性温度与时间：变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因失败的最主要原因一般一般9394lmin足以使模板足以使模板DNA变性变性若低于若低于93则需延长时间则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响

57、。此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导产物完全变性，就会导致致PCR失败失败 退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发，可使引物和模板发生结合。由于模板生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还

58、有靶基序列的长度度，还有靶基序列的长度对于对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引物，的引物，55为选择为选择最适退火温度的起点较为理想最适退火温度的起点较为理想引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）复性温度复性温度=Tm值值-（510）在在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性反应的特异性复性时间一般为复性时间一般为3060sec，足以

59、使引物与模板之间完，足以使引物与模板之间完全结合全结合 延伸温度与时间：延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 70 60核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 55 24核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 高于高于90时，时，DNA合成几乎不能进行合成几乎不能进行 延伸温度与时间：延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在7075之间之间常用温度为常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb

60、以内的以内的DNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min（足够）（足够）34kb的靶序列需的靶序列需34min扩增扩增10Kb需延伸至需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些循环次数循环次数循环次数循环次数决定决定PCR扩增程度扩增程度循环次数循环次数主要取决于模板主要取决于模板DNA的浓度的浓度循环次数：选在循环次数：选在3040次之间次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多PCRPCR反应特点反应特点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高简便、

61、快速简便、快速对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低特异性强特异性强关键：引物与模板的正确结合关键：引物与模板的正确结合引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的的合成反应的忠实性及合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的

62、靶基因区，其特异性程度就更高因区，其特异性程度就更高PCRPCR反应的特异性决定因素反应的特异性决定因素引物与模板引物与模板DNA特异正确的结合；特异正确的结合；碱基配对原则；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性靶基因的特异性与保守性灵敏度高灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模量级的起始待测模板扩增到微克板扩增到微克(ug=10-6)水平水平从从 100 万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞在病毒的检测中，在病毒的检测中，PC

63、R 的灵敏度可达的灵敏度可达 3 个个RFU(空斑形成空斑形成单位单位)在细菌学中最小检出率为在细菌学中最小检出率为3个细菌个细菌简便、快速简便、快速PCR反应用耐高温的反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一次性地将反应聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在液加好后，即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性扩增液和水浴锅上进行变性-退退火火-延伸反应，一般在延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广染、易推广对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低不需分离病毒或细菌及培养细胞，不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板均可作为扩增模板可直接用临床标本如血液、体腔液、洗可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测扩增检测