chapter1蛋白质section2

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1、 第三节第三节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构蛋白质蛋白质是由一条是由一条(单体蛋白质单体蛋白质)或多条或多条(寡聚蛋白质寡聚蛋白质)具有具有确定的氨基酸序列的多肽链以特殊方式结合而成的生物确定的氨基酸序列的多肽链以特殊方式结合而成的生物大分子。大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大,从大约从大约6000到到1000000道尔道尔顿甚至更大顿甚至更大。单纯蛋白质（单纯蛋白质（simple protein)simple pro

2、tein)：仅由氨基酸组成，不含其：仅由氨基酸组成，不含其它化学成分。它化学成分。缀合蛋白质缀合蛋白质(conjugated protein)(conjugated protein)：除含有氨基酸外的各种：除含有氨基酸外的各种化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为辅基辅基(prosthetic group)(prosthetic group)或或配体配体(ligand)(ligand)。单纯蛋白质单纯蛋白质 （按溶解度分类）（按溶解度分类）清蛋白清蛋白球蛋白球蛋白谷蛋白谷蛋白谷醇溶蛋白谷醇溶蛋白组蛋白组蛋白鱼精蛋白鱼精蛋白硬蛋白硬蛋白 缀合蛋白

3、质缀合蛋白质 （按非蛋白质（按非蛋白质 成分分类）成分分类）糖蛋白糖蛋白脂蛋白脂蛋白核蛋白核蛋白磷蛋白磷蛋白金属蛋白金属蛋白血红素蛋白血红素蛋白黄素蛋白黄素蛋白单纯蛋白质分类单纯蛋白质分类缀合蛋白质分类缀合蛋白质分类 蛋白质蛋白质（按生物学功能分类）（按生物学功能分类）酶酶调节蛋白调节蛋白转运蛋白转运蛋白贮存蛋白贮存蛋白收缩和游动蛋白收缩和游动蛋白结构蛋白结构蛋白支架蛋白支架蛋白保护和开发蛋白保护和开发蛋白异常蛋白异常蛋白蛋白质的形状和大小蛋白质的形状和大小形状形状纤维状纤维状球状球状膜蛋白膜蛋白蛋白质的相对分子量从大约蛋白质的相对分子量从大约600060001 110106 6或更大一些。或

4、更大一些。单体蛋白质单体蛋白质(monomeric(monomeric protein)protein)：仅由一条多肽链组成。：仅由一条多肽链组成。其相对分子量除以其相对分子量除以110(110(128-18)估计氨基酸残基的数目。即：估计氨基酸残基的数目。即：N AA=M/110 寡聚蛋白质寡聚蛋白质(oligomeric(oligomeric protein)protein)：由两条或多条多肽链：由两条或多条多肽链组成。每条多肽链称为亚基组成。每条多肽链称为亚基(subunit)(subunit)。蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次一级结构一级结构(prima

5、ry structure)(primary structure)：多肽链的多肽链的氨基酸氨基酸序列。序列。二级结构二级结构(secondary structure)(secondary structure)：多肽链中多肽链中主链原子主链原子的空的空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。三级结构三级结构(tertiary structure)(tertiary structure)：蛋白质的多肽链在各种二蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三三维空间结构维空间结构。四级结构四级

6、结构(quarternary structure)(quarternary structure)：具有具有二条或二条以上二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。键相互组合而形成的空间结构。蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性 蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种特异性的结构基础。特异性的结构基础。1.1.催化；催化；2.2.调节；调节；3.3.转运；转运；4.4.贮存；贮存；5.5.运动；运动；6.6.结构成分；结构成分；7.7.

7、支架作用；支架作用；8.8.防御与进攻；防御与进攻；9.9.异常异常功能；功能；蛋白质（蛋白质（proteinprotein）是生活细胞内含量最丰富、功能最）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。的命题。生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：的体现者，具有以下主要功能：一一.基本问题基本问题-肽肽一个氨基

8、酸的氨基与另一个氨一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的基酸的羧基之间失水形成的酰胺酰胺键键称为肽键，所形成的化合物称称为肽键，所形成的化合物称为肽。为肽。（公认的（公认的pro组织方式，组织方式，证据？）证据？）由两个氨基酸组成的肽称为二由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽（寡肽？）。组成多肽的为多肽（寡肽？）。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸单元称为氨基酸残基氨基酸残基。n在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序氨基酸顺序n通常在多肽链的一端含有一

9、个游离的通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基，称为氨基端氨基端或或N-N-端；端；在另一端含有一个游离的在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基，称为羧基端羧基端或或C-C-端。端。n氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨基酸残基为端氨基酸残基为终点的排列顺序。终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSer-Val-Tyr-Asp-GlnCCNCCNCCNCCNCC H2C HC H2C H2C H2C O O-O HC O2HC H2C O N H2O HC H3H3N+

10、OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnC H3N-端C-端肽键 1.多肽多肽肽链写法肽链写法：游离：游离-氨基在左，游离氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。表示肽键。2.肽键肽键 肽键的特点是氮原子肽键的特点是氮原子上的孤对电子上的孤对电子(2s2)与与羰基具有明显的羰基具有明显的共轭作共轭作用用(共振相互作用共振相互作用)。组成肽键的组成肽键的6个原子个原子处于同一平面处于同一平面(肽平面肽平面)。肽基的肽基的C、O和和N原子间的共振相互作用原子间的共振相互作用共振产生的重要结果：共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转限制绕肽键的自

11、由旋转 形成酰胺平面形成酰胺平面 产生键的平均化产生键的平均化 大多数情况下大多数情况下(除除Pro)，肽键呈反式，肽键呈反式构型构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体共振杂化体由于羰基碳由于羰基碳-氧双键的靠拢，允许存在共振结构（氧双键的靠拢，允许存在共振结构（resonance structureresonance structure），），碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由CO-NHCO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化，肽键中的和平面化，肽键中的4 4个原子和它相邻的两个个原子和它相邻的两个-碳原子多处于同一个平面碳原子

12、多处于同一个平面上。上。多肽链可以看成由多肽链可以看成由C C串联起来的无数个酰胺平面组成串联起来的无数个酰胺平面组成3.肽的物理和化学性质：肽的物理和化学性质：游离游离-NH-NH2 2：PHPH碱性低，碱性低，化学性质相似化学性质相似(与与AAAA中比较中比较)游离游离-COOH-COOH：PHPH酸性低，酸性低，化学性质相似化学性质相似(与与AAAA中比较中比较)侧链侧链R R基：基：PHPH活性和活性和化学性质化学性质与与AAAA中相似中相似短肽的晶体是离子品格，在水溶液中以偶极离子存在。在短肽的晶体是离子品格，在水溶液中以偶极离子存在。在pH0-14pH0-14范围内，肽键中的亚氨基

13、不能解离。范围内，肽键中的亚氨基不能解离。小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。肽的化学反应也和氨基酸一样，游离的肽的化学反应也和氨基酸一样，游离的氨基、氨基、羧羧基和基和R R基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反反应。基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反反应。双双缩脲反应缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。个颜色反应。一般短肽的一般短肽的旋光度旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度的总和，但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相的总和，但较长

14、的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相加。加。净电荷的计算净电荷的计算(P166-167)4.天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽谷胱甘肽(GSH)；蛇毒多肽等。；蛇毒多肽等。NHCOC H2N HCOC HN HCO

15、C H3C HC HO HC H2O HC HH NCN HC HCN HC H2CCOC HNHH OC H2N HN HC HC HC H3C H2C H3COOOOC H2C H2SOO H鹅 膏 覃 碱 的 化 学 结 构 谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSHGSH）：三肽（：三肽（Glu-Cys-GlyGlu-Cys-Gly），广泛存在于生），广泛存在于生物细胞中，含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为物细胞中，含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。遭氧化，使其处于

16、活性状态。+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽C y sT y rI L eG l nA s nC y sP r oL e uG l yN H2SS牛催产素C y sT y rG l nA s nC y sP r oSSP h eA r gG l yN H2牛加压素 二二.蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 1.蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primary structure)包括：包括：(1)组成蛋白质的多肽链数目；组成蛋白质的多肽链数目；(2)多肽链的氨基酸顺序多肽链的氨基酸顺序

17、；(3)多肽链内或链间二硫键的数多肽链内或链间二硫键的数目和位置。目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。的基础。2.蛋白质的一级结构的测定蛋白质的一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上万测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上万种不同蛋白质的一级结构被测定种不同蛋白质的一级结构被测定。A.样品必需纯（97%以上）；B.知道蛋白质的分子量；(2)测定蛋白质分子中多肽测定

18、蛋白质分子中多肽链的数目：链的数目：通过测定末端氨基通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质的摩酸残基的摩尔数与蛋白质的摩尔数尔数(m/M)之间的关系，即可之间的关系，即可确定多肽链的数目。确定多肽链的数目。多肽链的拆分：多肽链的拆分：由多条多肽链组由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用可用8mol/L尿素或尿素或6mol/L盐酸盐酸胍胍处理，即可分开多肽链处理，即可分开多肽

19、链(亚基亚基).二硫键的断裂：二硫键的断裂：几条多肽链通几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在用过二硫键交联在一起。可在用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍盐酸胍存在下，存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。巯基的保护-OOCCHCH2SHNH3+ICH2CNH2OCH2OCClOCH2Cl-OOCCHCH2

20、SNH3+OCCH2OCH2-OOCCHCH2SNH3+CH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；分析多肽链的分析多肽链的N-末端和末端和C-末端末端 末端氨基酸的测定：末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：游离氨基游离氨基在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与与N-N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰端氨基酸

21、的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优氨基酸。此法的优点是丹磺酰点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9M M。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸游离氨基的反应，生成游离氨基的反应，生成PTH-AAPTH-AA衍生物可用有机溶剂抽提、干燥后做鉴定衍生物可用有机溶剂抽提、干燥后做鉴定此法是多肽链此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条

22、件下加热，水条件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛苯甲醛缩合成不缩合成不溶于水的物质而与溶于水的物质而与C-C-端氨基酸分离端氨基酸分离。H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸(n-1)氨肽酶是一种肽链氨肽酶是一种肽链外切酶外切酶，它能从多肽链的，它能从多肽链的N-N-端逐端逐个的向里水解。根个的向里水解。根据据不同的反应时间测出酶水解所释放出的

23、不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的学曲线，从而知道蛋白质的N-N-末端残基顺序。最常用的氨肽末端残基顺序。最常用的氨肽酶是酶是亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为，水解以亮氨酸残基为N-N-末端的肽键速度末端的肽键速度最大最大。E E、羧肽酶法：、羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐端逐个的水解。根个的水解。根据据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数

24、量，从而知道蛋白质的酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。目前常末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键末端残基的肽键。多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段:可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或

25、肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解的方法多肽的选择性降解的方法有：A.A.酶裂解法酶裂解法胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)(trypsin)这是最这是最常用的蛋白水解酶，专一性强，常用的蛋白水解酶，专一性强，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。得到的是以参与形成的肽键。得到的是以ArgArg或或LysLys为为C-C-末端残基的肽段，末端残基的肽段，肽段数目等于多肽链中肽段数目等于多肽链中ArgArg和和LysLys总数加总数加1 1。为了为了减少减少胰蛋白酶的胰蛋白酶的作用位点作用位点，可以通过化学修饰将其侧链，可以通过化学修饰将其侧链基因保护起来。用

26、基因保护起来。用马来酸酐马来酸酐可以保护可以保护LysLys残基侧链上的残基侧链上的NHNH2 2，胰蛋白酶就不会水解，胰蛋白酶就不会水解LysLys竣基参与形成的肽键，只能断竣基参与形成的肽键，只能断裂裂ArgArg羧基所形成的肽键；反之，如果用羧基所形成的肽键；反之，如果用1 1，2 2环己二酮环己二酮修饰修饰ArgArg的胍基，则胰蛋白面只能裂解的胍基，则胰蛋白面只能裂解LysLys羧基所形成的肽键。羧基所形成的肽键。如果想如果想增加增加多肽链中胰蛋白酶的多肽链中胰蛋白酶的断裂点断裂点，可以用，可以用丫丙啶丫丙啶处理处理多肽链样品，这时多肽链样品，这时CysCys残基侧链被修饰成类似残基

27、侧链被修饰成类似LysLys的侧链，也的侧链，也具有具有NHNH2 2。这样胰蛋白酶便能断裂。这样胰蛋白酶便能断裂CysCys羧基端的肽键。羧基端的肽键。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1R R1 1=Lys=Lys和和ArgArg侧链（专一性较强，水解速度快）。侧链（专一性较强，水解速度快）。R R2 2=Pro=Pro 水水解受抑。解受抑。糜蛋白酶糜蛋白酶(chymotrypin)(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶(C Chymotrypsin)hymotrypsin)：它断裂它断裂PhePhe、TrpTrp和和TyrTyr及其它疏水氨基酸

28、的羧基参与形成的及其它疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键。断裂键邻近的基团是碱性的，裂解能力增加；是酸性肽键。断裂键邻近的基团是碱性的，裂解能力增加；是酸性的，裂解能力将减弱。的，裂解能力将减弱。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点R R1 1=Phe,Trp,Tyr=Phe,Trp,Tyr时水解快时水解快;R R1 1=Leu=Leu，MetMet和和HisHis水解稍慢。水解稍慢。R R2 2=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点胃蛋白酶胃蛋白酶(pepsin)(

29、pepsin)它要求被断裂键两侧的残基都是疏水它要求被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸，如性氨基酸，如Phe-PhePhe-Phe。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的最适最适pHpH，前者是，前者是pH2pH2，后者是，后者是pH8-9pH8-9，由于二硫键在酸性条件，由于二硫键在酸性条件下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。R R1 1和和R R2 2Phe,Trp,Tyr;LeuPhe,Trp,Tyr;Leu以及以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。其它疏水性氨基酸水解速度较快。R R1 1=Pro=Pr

30、o 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点嗜热菌蛋白酶（嗜热菌蛋白酶（thermolysinthermolysin）:常用于断裂较短的多肽链。常用于断裂较短的多肽链。R R2 2=Phe,Trp,Tyr;Leu=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Val,MetIle,Val,Met以及其它疏水性强以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。的氨基酸水解速度较快。R R2 2=Pro=Pro或或Gly Gly 水解受抑。水解受抑。R R1 1或或R R3 3=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。葡萄球菌蛋白酶（葡萄球菌蛋白酶（S

31、taphylococcal protease)Staphylococcal protease)当裂解在当裂解在磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH7.8)(pH7.8)中进行的，它能在中进行的，它能在GluGlu残基和残基和AspAsp残基的残基的羧基侧断裂肽键。如果改用碳酸氢铵缓冲液羧基侧断裂肽键。如果改用碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)(pH7.8)或醋酸或醋酸铵缓冲液铵缓冲液(pH4.0)(pH4.0)时，则只能断裂时，则只能断裂GluGlu残基的羧基侧肽键。残基的羧基侧肽键。梭菌蛋白酶（梭菌蛋白酶（clostripainclostripain）专门裂解专门裂解ArgArg残基的羧基所形残基的羧基所形

32、成的肽键。即使在成的肽键。即使在6mol/L6mol/L尿素中尿素中2020小时内仍具活力，这样对小时内仍具活力，这样对不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。消化道内几种蛋白酶的专一性消化道内几种蛋白酶的专一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）（脂肪族）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶（Phe.Trp）B B、化学法：、化学法：溴化氰溴化氰水解法，它能选择性地切割由水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸甲硫氨酸的羧基所形成的羧基所形成的肽键的肽键。CH3S：CH

33、2CH2CHN HCN HCHCOOR+B rC+NB r-CH3S+CH2CH2CHN HCN HCHCOORCNCH3SCN CH2CHN HCN HCHCOORCH2+H2O+CH2CHN HCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯溴化氰基锍溴化氰基锍甲基硫氰酸甲基硫氰酸溴化亚氨内酯溴化亚氨内酯H2O肽酰肽酰 测定每个肽段的氨基酸顺序测定每个肽段的氨基酸顺序：EdmanEdman降解法降解法(PITC)、酶解法、酶解法、依核苷酸序依核苷酸序列的推定法列的推定法A A、目标蛋白、目标蛋白(抗原抗原)抗体抗体 多核糖体多核糖体 mRNA cDNA aamRNA cDNA aa序列序列B B

34、、Edman降解法降解法n由由Edman于于1950年首先提出，用于年首先提出，用于N末端分析末端分析n为为-NH2的的与与苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯（PITC）的反应）的反应 nEdman（苯异硫氰酸酯法）苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-N-端分端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一端氨基酸残基逐一进行标记和解离进行标记和解离。NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR1苯

35、氨基硫甲酰肽苯氨基硫甲酰肽噻唑啉酮苯胺噻唑啉酮苯胺少一个少一个AAAA残基的肽残基的肽苯乙内酰硫脲苯乙内酰硫脲AAAAn 确定肽段在多肽链中的次序：确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。酸顺序。确定原多肽链中二硫键的位置：确定原多肽链中二硫键的位置：一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换下防止二硫键发生交换)。将所得的肽段利用将所得的肽段利用BrownBrown及及Ha

36、rtlayHartlay的对角线电泳技术进行分离的对角线电泳技术进行分离（过甲酸过甲酸处理处理）。）。+-+-第二向第二向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑点是由两个斑点是由一个二硫键断裂产生的一个二硫键断裂产生的肽段肽段 -螺旋是链内形成氢键，其螺旋是链内形成氢键，其肽平面的键长和键角一定，肽键肽平面的键长和键角一定，肽键的原子排列呈反式构型，相邻的的原子排列呈反式构型，相邻的肽平面构成二面角。肽平面构成二面角。多肽链中的各个肽平面围绕多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成

37、螺旋结构，螺同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即旋一周，沿轴上升的距离即螺距螺距为为0.54nm,0.54nm,含含3.63.6个氨基酸残基个氨基酸残基；每个氨基酸残基绕轴旋转每个氨基酸残基绕轴旋转1001000 0，沿轴上升沿轴上升0.15nm0.15nm；肽链内形成氢键，氢键的取肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，向几乎与轴平行，第一个酰胺基第一个酰胺基团的团的-CO-CO基与第四个酰胺基团的基与第四个酰胺基团的-NHNH基形成氢键基形成氢键，即形成含有，即形成含有1313个个原子的环原子的环；蛋白质分子几乎都为右手蛋白质分子几乎都为右手-螺旋螺旋(原因：原因：R R基

38、与主链基与主链C=OC=O中的中的O O的空间位阻小的空间位阻小)；具有协同性效应。具有协同性效应。左手和右手螺旋左手和右手螺旋(1)-螺旋螺旋(3.613-螺旋螺旋)-折叠是由两条或多条几乎完全折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过伸展的肽链平行排列，通过链间链间的氢的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。状折叠构象。在在-折叠中，折叠中，-碳原子总是处于折碳原子总是处于折叠的角叠的角(线线)上，氨基酸的上，氨基酸的R R基团处于基团处于折叠的棱角上并与折叠的棱角上并与折叠片折叠片垂直垂直。-折叠结构的氢键主要是由两条折叠结构的氢键主要是由

39、两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与氢键的交联，氢键与链的长轴都参与氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的即所有肽链的N-N-端都在同一边。另一端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。向相反。（2）-折叠折叠反平行折叠平行折叠n7n7n6.5n从能量上看，反平从能量上看，反平折叠比平行的更稳定，前者的氢键折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH-O几乎在一条直线上，此时

40、氢键最强。几乎在一条直线上，此时氢键最强。n在纤维状蛋白质中在纤维状蛋白质中折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。中反平行和平行两种方式都存在。n在纤维状蛋白质的在纤维状蛋白质的折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，而在球状蛋白质中，折叠既可在不同肽链间形成，也可在折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。同一肽链的不同部分间形成。（三）（三）-转角（转角（-turn-turn）-转角也称转角也称-回折（回折（reversereverseturnturn）、）、-弯曲（弯

41、曲（-bendbend）、发夹结构（）、发夹结构（hair-pinhair-pinstructurestructure）-转角是球状蛋白质分子中出现的转角是球状蛋白质分子中出现的180180回折，有人称之为回折，有人称之为发夹结构，由第一个发夹结构，由第一个aaaa残基的残基的C=OC=O与第四个氨基酸残基的与第四个氨基酸残基的N-HN-H间形成氢键。间形成氢键。目前发现的目前发现的转角多数在球状蛋白质分子表面，转角多数在球状蛋白质分子表面，转角在球转角在球状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的1/41/4。转角的特征：转角的特征：由多肽链上由多肽链上4 4个

42、连续的氨基酸残基组成。个连续的氨基酸残基组成。主链骨架以主链骨架以180180返回折叠。返回折叠。第一个第一个aaaa残基的残基的C=OC=O与第四个与第四个aaaa残基的残基的N-HN-H生成氢键。生成氢键。C C11与与C C44之间距离小于之间距离小于0.7nm0.7nm多数由亲水氨基酸残基组成。多数由亲水氨基酸残基组成。GlyGly缺少侧链，在缺少侧链，在转角中能很好地调整其他氨基酸残基转角中能很好地调整其他氨基酸残基的空间阻碍；的空间阻碍；ProPro具有环状结构，在一定程度上迫使具有环状结构，在一定程度上迫使转转角的形成。角的形成。即：即：在在-转角部分，由四个氨基酸残基组成转角部

43、分，由四个氨基酸残基组成(4 4个个-碳，共碳，共3个酰胺平面个酰胺平面)，四个形成转角的残基中，第三个一般均为，四个形成转角的残基中，第三个一般均为甘氨酸残基甘氨酸残基(或或ProPro)。弯曲处的。弯曲处的第一个氨基酸残基的第一个氨基酸残基的 -C=O-C=O 和第四个残基的和第四个残基的 N-H N-H 之间形成氢键，之间形成氢键，形成一个不很稳定形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。主要的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。主要在球状蛋白的表面，约占全部残基的在球状蛋白的表面，约占全部残基的1/41/4。-凸起是凸起是-折叠股中额外插入了一个折叠股中额外

44、插入了一个AAAA残基残基（）无规卷曲（）无规卷曲没有一定规律的松散肽链结构没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象不定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象不同的蛋白质，无规卷曲的数量和形式各不相同同的蛋白质，无规卷曲的数量和形式各不相同球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。有关。超二级结构和结构域超二级结构和结构域（）超二级结构（）超二级结构在蛋白质分子中，由在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作组合

45、在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级合体。几种类型的超二级结构：结构：(在纤维状蛋白在纤维状蛋白和球状蛋白中异同；和球状蛋白中异同；七残七残基重复序列基重复序列 P220)；(大多为大多为右手交叉右手交叉)；超二级结构在结构超二级结构在结构层次上高于二级结构，但层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结没有聚集成具有功能的结构域构域 一些已知功能的一些已知功能的超二级结构超二级结构:（）结构域（）结构域 对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链

46、往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的相对独立的三维实体三维实体形成的形成的三级结构的局三级结构的局部折叠区部折叠区就称结构域。就称结构域。结构域通常是几个超二级结构的组合，是球状蛋白质的独立折叠单位；对于较结构域通常是几个超二级结构的组合，是球状蛋白质的独立折叠单位；对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域，如肌红蛋小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域，如肌红蛋白；较大的蛋白由两个或两个以上的结构域组成。白；较大的蛋白由两个或两个以上的结构域组成。结构域一般由结构域一般由1001002

47、00 200 个氨基酸残基组成，但个氨基酸残基组成，但大小大小范围可达范围可达 4040400 400 个残基。个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的 结构域之间常形成结构域之间常形成裂隙裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上性中心往往位于两个结构域的界面上 结构域之间由结构域之间由“铰链区铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动相对运动(别构效应别构效应)，使蛋白质分子实现一定的生物功能。，

48、使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动相对独立的运动，水解出来后仍，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性结构域与功能域的关系：结构域与功能域的关系：有时一个结构域就是蛋白质的功能域，有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是；但不总是；功能域包含一个但通常是多个结构域功能域包含一个但通常是多个结构域蛋白质的三级结构与球状蛋白质蛋白质的三级结构与球状蛋白质 蛋白质的三级结构是指多肽链在二蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，级结构的基

49、础上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构从而生成特定的空间结构。包括主链。包括主链和侧链的和侧链的所有原子的空间排布所有原子的空间排布。一般。一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面。核，极性侧链在分子表面。Native ribonucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonuclease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis变性变性复性复性Ribonuclease A:Amino Acid Sequence Ribonuclease A:Amino

50、Acid Sequence Ribonuclease ARibonuclease AB B、二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用、二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用RNARNA酶肽链上的一维信息控制肽链自身折叠成特定的天然酶肽链上的一维信息控制肽链自身折叠成特定的天然构象，并由此确定了构象，并由此确定了CysCys残基两两相互接近的正确位置。残基两两相互接近的正确位置。二硫桥对肽链的正确折叠并不是必要的，但对稳定折叠结二硫桥对肽链的正确折叠并不是必要的，但对稳定折叠结构作出贡献。构作出贡献。蛋白质的三维结构归根到底是由一级序列决定的，三维结蛋白质的三维结构归根到底是由一级序列决定的，三维结构是多肽链上的

51、各个单键旋转自由度受到各种限制的总结构是多肽链上的各个单键旋转自由度受到各种限制的总结果。果。这些限制包括：肽链的硬度、肽链中疏水基和亲水基的数这些限制包括：肽链的硬度、肽链中疏水基和亲水基的数目和位置、带正电荷和负电荷的目和位置、带正电荷和负电荷的R R基的数目和位置以及溶基的数目和位置以及溶剂和其他溶质等。剂和其他溶质等。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构（1 1）有关四级结构的一些概念）有关四级结构的一些概念四级结构四级结构(quarternary structure)(quarternary structure)指由相同或不同的称指由相同或不同的称作亚基（作亚基（subunitsubun

52、it）的亚单位按照一定排布方式缔合而成的）的亚单位按照一定排布方式缔合而成的蛋白质结构。蛋白质结构。亚基一般是一条多肽链，有时也称单体。本身具有球状三亚基一般是一条多肽链，有时也称单体。本身具有球状三级结构。级结构。原（聚）体原（聚）体蛋白质蛋白质单体蛋白质单体蛋白质寡聚蛋白质寡聚蛋白质同多聚同多聚杂多聚杂多聚（2 2）四级结构的内容）四级结构的内容蛋白质的四级结构涉及亚基种类和数目以及各蛋白质的四级结构涉及亚基种类和数目以及各亚基或原聚体在整个分子中的空间排布，包括亚基或原聚体在整个分子中的空间排布，包括亚基间的接触位点（结构互补）和作用力（主亚基间的接触位点（结构互补）和作用力（主要是非共

53、价相互作用）。要是非共价相互作用）。对称性是四级结构的对称性是四级结构的重要性质重要性质(指亚基缔合指亚基缔合)。（3 3）在结构与功能上的优势：）在结构与功能上的优势：增强结构的稳定性：表面积增强结构的稳定性：表面积/体积体积 变小；变小；提高遗传经济性和效率；提高遗传经济性和效率；使催化基团汇集在一起；使催化基团汇集在一起；具有协同效应和别构效应。具有协同效应和别构效应。别构效应别构效应指结合在多亚基蛋白质分子的特定部指结合在多亚基蛋白质分子的特定部位位(受体受体)上的配体对该分子的其他部位所产生上的配体对该分子的其他部位所产生的影响。分为同促效应和异促效应的影响。分为同促效应和异促效应四

54、蛋白质分子中的共价键与次级键四蛋白质分子中的共价键与次级键一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构疏水键、离子键、氢键、范疏水键、离子键、氢键、范得华力。（得华力。（亚基缔合的驱动力主要是疏水相互作用，亚基亚基缔合的驱动力主要是疏水相互作用，亚基缔合的专一性则由相互作用的表面上的极性基团之间的氢缔合的专一性则由相互作用的表面上的极性基团之间的氢键和离子键提供键和离子键提供）a.盐键（离子键）b.氢键 c.疏水作用力 d.范德华力 e.二硫键氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键离子键氢键氢键范德华力范德华力疏水相互作用力疏水相互作用力