《白细胞血型》PPT课件.ppt

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1、第七章 白细胞血型,第一节 概述,一、概念 （一）人类白细胞膜上的抗原分类： 1、红细胞血型抗原，如ABH抗原等。 2、白细胞本身特有的抗原，如CD4、CD8等。 3、与其他组织共有的同种抗原，即人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）。,1、在研究小鼠的肿瘤移植时发现有一种抗原支配着移植的成败，这种代表个体特异性的同种抗原称为移植抗原或组织相容性抗原或组织抗原。 机体内与排斥反应有关的20多个抗原系统中，能引起强而迅速排斥反应的抗原称为主要组织相容性抗原。 2、编码这些抗原的基因位于同一染色体片段上，形成一组紧密连锁的基因群，称为主要组织相容性复合体（MHC

2、）。 人类：HLA系统 ；小鼠：H-2系统；狗：DL-A系统. MHC编码产物称为MHC抗原或MHC分子，HLA。,（二） 主要组织相容性复合体( MHC ),3、HLA系统是人类最复杂的显性遗传多态性系统，也是迄今为止人类基因组中基因密度最高的区域。 重要功能： （1）参与、控制、调节免疫应答；对异体移植物的排斥；肿瘤监视；参与自身免疫疾病的发生等。 （2） 法医学的个体识别和亲权鉴定。,二、HLA研究简史 1958年 Dausset发现HLA-A2抗原，标志着 HLA研究的开始 1962年 Van Rood发现了4a，4b双等位基因 开辟了白细胞分型的道路 1964年 召开第一届国际组织相

3、容性研讨会 揭开了HLA研究国际大协作的序幕 1965年 确定了HLA是人类主要组织相容性 抗原 1974年 证实了HLA系统位于人类第6号染色 体上 1999年 人类基因组计划将HLA编码基因全 部解密,三、HLA-类与类抗原结构及细胞分布,（一） HLA-类抗原的结构 1、HLA-类基因产物为HLA-A、B和C抗原，是糖蛋白，由重链和轻链两条多肽链构成，以非共价键连接； 2、轻链为2微球蛋白（2-microglobulin，m）,由15号染色体长臂上的2m基因控制，没有多态性。 3、重链（链）由HLA-A、B、C 基因控制产生，具有多态性； 分为5个区域： 1结构域、 2结构域、 3结构域

4、、跨膜区和胞浆区。 羧基端插入细胞膜，氨基端大部分有利于细胞膜表面，分为3个结构域，从氨基端向细胞膜依次为1、 2、 3 结构域， 3结构域较恒定，1、2结构域具有高度可变性，形成多态性。 4、1和2结构域形成抗原决定槽，类抗原分子中的抗原决定槽两端是封闭的，只可以提呈8-9个氨基酸的短肽。,（二） HLA- 类抗原的结构,1、类基因产物为HLA-DR、DQ、DP抗原，为跨膜糖蛋白，由链和链构成。DR链无多态性，DQ链和DP链有多态性。 链均有多态性。 2、 链和链在细胞膜外折叠成4个结构域： 1、 2、 1 和2； 类抗原多态性由离细胞膜最远的1和1所决定。 3、类抗原分子中的抗原决定槽两端

5、是开放的，可以提呈15-24个氨基酸的长肽。,（三） HLA抗原的细胞分布,1、HLA-类抗原分布广泛，几乎分布于所有的有核细胞表面，以淋巴细胞上的密度最高。正常情况下，心肌细胞和肝细胞HLA抗原极少或没有。 血浆中有可溶性HLA-类抗原，可能为细胞膜代谢产物。 成熟红细胞上没有HLA-A、B、C、DR抗原，幼稚红细胞却有；年轻红细胞上有少量HLA抗原。 血小板自身带有HLA-类抗原，还可以从血浆中吸附可溶性HLA-类抗原。 2、HLA-类抗原分布远不如类抗原分布，主要存在于树突状细胞、单核细胞等具有吞噬功能的细胞、B细胞及活化的T细胞等。,第二节 HLA命名,HLA命名主要原则 基因座 1、

6、以大写字母A、B、 C 、DR、DP、DQ表示HLA编码抗原的基因座位。 抗原 2、A、B基因座上的抗原以发现的先后次序排列； A、B基因座抗原不重复 A：1，2，3，9，10 B：5，7，8，12，13等 C 、DR、DP、DQ基因座上的抗原编号从1、2顺次开始。 3、为避免C位点与补体系统命名混淆， HLA-C位点上的抗原以 Cw为字首命名，如Cw6.,基因 4、HLA基因命名一般以4位数字表示，其中前两位表示对应最相近的HLA抗原特异性，后两位数字表示亚型的等位基因。如A0101和A0102。 5、如果出现第五位数字，则代表“沉默取代”，即该基因中虽然发生个别碱基的替换，但不影响所编码的

7、氨基酸序列。如A31011和A31012。 6、第6、7位数字代表相应的启动子（包括内含子或侧翼序列）等的多态性。如DRB40101102. 7、末尾加英文字母N表示无效等位基因或不表达基因，如DRB40101102N. 8、在不能区分等位基因时，可允许取最前面的2位或4位数字表示该HLA基因座的特异性。如A02或DRB40111。,HLA命名在不断修改： 1、原来命名的抗原特异性可被进一步细分 宽特异性：某些特异性抗原可被分解后形成多种特异性抗原，例如，HLA-A9可分解为A23和A24，前者称为宽特异性， A23 和A24是A9的分裂抗原，称为窄特异性或亚型。 HLA-A23(9) , H

8、LA-A24(9) HLA-B60(40),HLA-B61(40) 同理，抗-A9血清含有抗-A23和抗-A24特异性。 前者称为宽特异性体，后两者称为窄特异性抗体。 2、抗原特异性不断被合并,第三节 HLA遗传,一、 HLA基因定位与基因结构 1、人白细胞抗原(HLA)系统定位于6p21.31，长3600Mb，占整个基因组全部碱基序列的0.12%，由一系列紧密连锁的基因座组成最具有多态性的复合遗传系统。 HLA结构十分复杂,其多样性由多基因性和多态性两方面构成.,2、HLA系统共分I类、II类和III类三个基因区。 从着丝点一侧起依次：为类基因、类基因和类基因区域,6号染色体,基因区,3、I

9、类基因区： 主要由3个I类基因座，每个基因座编码I类抗原的一条重链，轻链(链)由2微球蛋白基因编码。 I类基因含有8个外显子和7个内含子，多态性主要有外显子2和外显子3决定。 （）经典基因：HLA-A、B、C基因。均编码抗原分子的重链(链)，抗原广泛分布。 （）非经典基因：HLA-E、F、G和H基因。也编码I类蛋白，称为HLA Ib基因。等位基因数目少，多态性程度低。 （3）存在假基因（图中以红色表示）。,4、II类基因位于HLA-D区： II类基因主要有HLA-DR 、DQ、 DP三类，分别编码相应抗原分子的链和链，形成HLA-DR 、DQ、 DP抗原分子。 （）DQ区：DQA; DQB。D

10、QA1和DQB1为功能基因；A2、B2和B3为假基因。 （） DP区：DPA; DPB。 DPA1和DPB1为功能基因；A2和B2为假基因。 （） DR区：DRA; DRB1-9。一个DRA 和DRB1、DRB3、DRB4和DRB5为功能基因，DRB1的等位基因有271个，其他为假基因。 DRB会形成几种不同的基因重排，基因数随单倍型的不同而变化，表达出的链数目也不同 以上3个区为经典HLA II类经典基因，其余为非经典基因。,HLA复合体类和类基因区内的基 因 名 称,H LA系统的基因座位(1997) HLA I类区域 HLA类区域 HLA类区域 HLA-A HLA-DRA C2 HLA-

11、B HLA-DRB1 HLA-DRB9 Bf HLA-C HLA-DQA1HLA-DQA2 C4A HLA-E HLA-DQB1HLA-DQB3 C4B HLA-F HLA-DPA1HLA-DPA2 TNF HLA-G HLA-DPB1HLA-DPB2 LTA HLA-H HLA-TAP1HLA-TAP2 LTB HLA-J HLA-DMB HLA-LMP2 HSP HLA-K HLA-DMA HLA-LMP7 HLA-L HLA-DOB HLA-DOA,二、HLA遗传特征,（一）共显性遗传： 1、每个HLA基因座表达一对抗原，组成某个体该基因座的表型，一般为杂合子。 2、若检测到A1、A2两

12、种抗原则记为 HLA-A1，2。 3、若只检测到A1,则记为HLA-A1，。 原因： （1）是该抗原的纯合子，即HLA-A1，1 （2）HLA抗血清板不完全，缺少针对某抗原的抗体，漏检了该抗原； （3）存在一个至今尚未发现的新抗原。称为空白抗原,（二）单倍型遗传 1、单倍型（haplotype）是指一条染色体上HLA各基因座的基因紧密连锁组成的基本遗传单位。 2、在HLA血型的遗传中， HLA单倍型作为一个完整的遗传单位由亲代传给子代，子代HLA单倍型一个来自父亲，一个来自母亲。 3、同胞之间HLA单倍型比较有3种可能 （1）有1/4机会HLA单倍型完全相同； （2）有1/4机会HLA单倍型完

13、全不相同； （3）有1/2机会HLA单倍型一半相同，即共有一个单倍型。,HLA表型、基因型、单倍型之间的关系,A1,A2,Cw1,Cw2,B8,B8,DR3,DR3,基因型 A1,2; B8,8; Cw1,2; DR3,3,表现型 A1,2; B8,-; Cw1,2; DR3,-,单倍型 A1, B8, Cw1, DR3 / A2, B8, Cw2, DR3,HLA的单倍型遗传图,（重组）,母亲,父亲,子1,子2,子3,子4,A,B,C,D,A,A,B,B,C,C,D,D,（三）HLA系统的连锁不平衡 （1）处于H-W平衡时，基因座相互独立，不存在连锁关系，不同基因座的上的基因组成一个单倍型的

14、频率等于各基因频率的乘积（符合乘积定律）。 （2）HLA-A1和HLA-B8频率分别为0.17和0.11。若随机组合，则单倍体A1-B8的预期频率（理论频率）应为0.019；但实际观察到的频率却为0.088。 （3）连锁不平衡：HLA各基因座的基因并非完全随机组成单倍型，有些单倍型观察频率高于或低于期望频率，这种现象称为连锁不平衡。,三、HLA 群体分布 不同种族、不同民族、不同地区之间HLA抗原分布不尽相同。,第四节 HLA分型 HLA分型方法主要有3类： 1、微量淋巴细胞毒试验用于检测HLA-A、B、C、DR和DQ基因座的抗原； 2、淋巴细胞培养试验用于检测HLA-D和DP抗原； 3、DN

15、A分型可检测HLA所有等位基因。,一、血清学分型 （一）微量淋巴细胞毒性试验 1、概念：又称为补体依赖的细胞毒试验，首先由Terasaki在1964年建立，后经美国国立卫生研究院（NIH）标准化，故又称NIH技术。 2、基本原理: 淋巴细胞膜上的HLA抗原与已知HLA血清中相应抗体结合后，形成抗原-抗体复合物， 再结合补体。被激活的补体系统产生细胞毒性，攻击并破坏淋巴细胞。 经过染色，染料进入破损淋巴细胞内着色，为阳性结果。如果抗原与抗体未结合形成复合物，则不能结合补体，淋巴细胞膜完整，染料无法进入淋巴细胞内，为阴性结果,3、分型方法步骤: （1）从全血中分离淋巴细胞：用于HLA-A、B、C分

16、型。 （2）T、B细胞分离:可进行HLA-DR、DQ分型。 （3）微量淋巴细胞毒试验 取外周血分离淋巴细胞 HLA分型板孵育 补体 染料固定 结果判读 4、结果判读: 淋巴细胞毒试验记分标准,死细胞(%) 记分 意义 0-10 1 阴性 11-20 2 可疑阳性 21-40 4 弱阳性 41-80 6 阳性 81-100 8 强阳性,5、注意事项: （1）多种细菌的代谢产物会抑制抗HLA血清的淋巴细胞毒作用，若受到细菌、真菌等的污染，会影响试验结果的准确； （2）操作时间过长，温度过高或过低都会影响试验结果的准确。,（二）HLA抗血清与交叉反应 1、HLA抗体生成途径：同种免疫、异种免疫、单克

17、隆抗体、天然抗体 （1）通过妊娠、输血、同种器官移植等免疫作用，产生同种抗体； （2）用纯化的HLA抗原免疫动物，产生异种抗体； （3）用杂交瘤技术，制备单克隆抗体； （4）偶有“天然”HLA抗体。 大多数为免疫抗体，属IgG，少数为IgM。 2、根据与抗原决定簇的反应，将HLA抗体分为2组 （1）仅与一种HLA基因产物反应的抗体，这些抗体只与独有的表位结合。 （2）能与两种以上HLA基因产物反应的抗体，这种抗体能与结构类似的两种以上表位或几种HLA基因产物的共有表位结合，产生血清学交叉反应。,3、交叉反应表现 HLA血型系统的抗原抗体反应中存在广泛的交叉反应，同一基因座上的不同抗原之间在不同

18、水平上表现出交叉反应性。 （1）一种特异性抗体可与多种抗原反应； （2）一种抗原特异性的淋巴细胞可以刺激产生多种特异性抗体。 4、产生交叉反应的原因： （1）HLA抗原由同一个分子上高度关联的若干表位组成，这些表位具有不同的免疫原性，可以刺激产生不同的同种抗体； （2）2个结构类似的抗原决定簇可以与同一个抗体结合； （3）HLA的交叉反应可能由“复合抗体和复合抗原”引起。,HLA-抗原共有表位： 超型: HLA-B座位上的Bw4和Bw6两者包括全部B座位的抗原特异性，故又称为“超型”。 Bw4和Bw6抗血清可与它们各自所包含的B座位特异性HLA抗原反应。 与Bw4、Bw6抗血清相关特异性反应抗

19、原,抗血清,Bw4,Bw6,反 应 抗 原,B5.B13.B17.B27.B37.B38. B44.B47.B49.B51.B52,B7.B14.B18.B22.B35.B40. B41.B42.B45.B50.B60,HLA-A基因座交叉反应,A11,A1,A3,Aw36,A26Aw66A25Aw34,A10,Aw68Aw69,A28,A2,A23A24,A9,.,二、细胞学分型 （淋巴细胞培养试验） HLA-DP抗原特异性可应用纯合子分型细胞(homozygous typing cell，HTC)和预致敏淋巴细胞试验(primed lymphocyte test，PLT)检测。 两种方法的

20、原理均是通过混合淋巴细胞培养试验判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及实验方法繁琐，细胞学分型技术已经被淘汰。,三、DNA分型 (一)PCR-RFLP (二)PCR-SSO 1、斑点杂交（Dot-blot）：将PCR扩增片段制成斑点，用等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，通过探针放射自显影结果进行HLA分型。 反向斑点杂交（RDB）：将特异性探针预先固定在膜上，标记PCR引物。 2、PCR-微量滴度板杂交法（PCR-MPH）,尼龙膜,固定在膜上 的PCR产物,标记的 SSO探针,X线片,斑点杂交,反向印迹杂交,PCR-微量滴度板杂交法（PCR-MPH）,无色底物,显色,固定在膜上的探针,(三)PCR-SSP分型方法 根据等位基因的序列，设计具有序列特异性的引物，对样本进行DNA分型。该方法特异性强、重复性好、结果易于判定。 （四）测序分型方法 采用荧光标记引物PCR循环测序法，直接从序列上读取多态性信息，可以消除其他各种分型方法的不确定性，是最精确的分型方法。,