14种病害的科赫法则试验

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1、下面文字，仅供参考14种病害的科赫法则实验从田间采回的患病植株上，可能会培养出多种微生物。分离出的微生物，可能是病原菌，也可能是二次侵入菌（secondaryinvaders），更可能是腐生菌（saprophytes）。欲证明病原菌的致病性（pathogencity），科赫法则（Kochspostulates）是不二法门。科赫法则：（1）在病株患病部位常可发现可能的病原菌。（2）病原菌常可在培养基被分离培养（记录各项特征）。（3）纯培养的病原菌应接种至与病株相同品种的健康植株，并产生与病株相同的病征。（4）从接种的病株上以相同的分离方法应能再分离（reisolate）出病原菌，且其特征与由原病

2、株分离的应完全相同。严格地说，科赫法则并不能适用于所有的植物病原。绝对寄生性病原，如锈病菌、露菌、白粉菌、病毒等，即无法进行纯粹培养。因比必须以其它的方法分离、纯化或培养在生物体中，才能进一步证明其中病原性。例如锈病菌、白粉菌等可取单孢接种于适当的健康寄主组织以进行分离、纯化并培养，以鉴定其特性。虽然科赫法则费时、费力，却是不得不进行的验证。因为只有按照该法则才能证明病原菌的病原性，任何病害的病原菌若未经科赫法则或其它类似的方法证明其病原性，将不具任何说服力。（1）水稻纹枯病（Rhizoctoniasolani分离：组织分离法或以菌核分离分离用培养基：wateragar培养及保存用培养基：PD

3、A接种法：菌丝块接种法（a）由纯粹培养的菌落，切取适当大小之菌丝块，置入水稻叶鞘内。（b）水稻植株套以大型塑料袋，保持高湿度1-2天。（c）连续观察1-2周，并记录病征。(d) 以未接种菌源之培养基块为对照。(2)水稻白叶枯病(Xanthomonascampestripv.ozae)分离法：划线平板法或稀释平板法分离用培养基：NA或PDA接种法：剪叶接种法(a) 挑起纯培养的菌落至无菌水，形成悬浮液(略成混浊状)。(b) 以灭菌的剪刀沾细菌悬浮液。(c) 剪下部分水稻叶片。(d) 水稻植株套以大型塑料袋，保持高湿度1-2天。(e) 连续观察1-2周，并记录病征。(f) 以无菌剪刀沾无菌水剪叶以

4、为对照。(3)水稻徒长病(Fuasriummoniliforme)分离法：组织分离法、稀释平板法或划线平板法。分离用培养基：WA或PCNBmedium培养及保存用培养基：cornmealagar或PDA接种法：种子接种法(a)以1%chlorox消毒水稻种子，并以无菌水漂洗。(b)一部分种子阴干，一部分催芽(浸泡无菌水24hr)(c)以无菌水制成翘子悬浮液(1x1ospore/ml)(d)催芽种子浸泡在翘子悬浮液24hr后取出。(e)未催芽的种子浸孢子悬浮液后取出阴干。(f)上述种子分别种入土盆中，连续观察病征1-4周并记录病征(g)以无菌水取代孢子悬浮液为对照。(4)蕃茄靑枯病(Pseudo

5、monsasolanacearum)分离法：划线平板法或稀释平板法。分离用培养基：NA或TCCmedium培养用培养基：NA或523mrdium保存用培养基：NA或无菌水。接种法：剪根接种法(a)取蕃茄幼苗，洗净培养基质(蛭石或泥炭土)(b) 以灭菌剪刀剪去根部尖端。(c)幼苗浸入无菌水配制的细菌悬浮液lhr。(d)将幼苗植入土盆中，连续观察病征1-4周并记录。(e)以无菌水浸剪根幼苗为对照。(5)蕃茄幼苗疫病(Phytophthoracapsici)分离法：组织分离法或诱钓法分离用培养基：WA或Kosmedium培养(产孢)用培养基：V-8medium或无菌水接种法：菌丝块接种法(a)取纯粹

6、培养的菌丝块。(b)用胶带将菌丝块黏于蕃茄幼苗的茎部(菌丝面与组织接触)。(c) 套上塑料袋以保持高湿度1-2天。(d)连续观察病征1-2周，并记录病征。(6)蕃茄萎凋病(Fuasriumoxysporumf.sp.lycopersici)分离法：组织分离法(取维管束变色部位)分离用培养基：WA或PCNBmedium培养(产孢)用培养基：PDB(potatodextrosebroth):PDA不含agar即是PDB。Fuasriumoxysporumf.sp.lycopersici于PDB中震荡培养3-5天，即可产生大量小孢子。保存用培养基：PDA接种法：浸根法(rootdipmethod)(

7、a)培养病原菌3-5天的PDB离心收集孢子(3000rpm10min)。(b)弃PDB，并以无菌水洗孢子数次。(c)以无菌水悬浮孢子成悬浮液。(d)拔取蕃茄幼苗(造成根部伤口)。(e)浸入孢子悬浮液数分钟。(f)将幼苗植入土盆中，并将孢子悬浮液倒入土盆内。(g)连续观察1-4周，并记录病征。(h)以无菌水取代孢子悬浮液为对照。(7)蕃茄癌肿病(Agro力acteriumtumefaciens)分离法：划线平板法：本病原菌是geneticparasite，因此在病组织中含量不高，最好取新鲜肿瘤组织(白色)进行分离。取数块白色肿瘤组织于无菌水中切碎，静置30分钟后或更久，在划线于平板上。分离用培养

8、基：WA培养用培养基：523medium或NA保存用培养基：NA或无菌水接种法：穿刺法:(a)牙签灭菌后，在蕃茄基部或地部穿剌造成伤口。(b)以灭菌棉花沾无菌水配制的细菌悬浮液涂抹于伤口处或以牙签挑取菌落，直接穿刺于蕃茄茎部并将牙签留置于剌伤处。(c)套袋保持高湿1-2天。(d)连续观察病征1-4周，并记录。(e)以无菌水取代细菌悬浮液为对照。(8)蕃茄早疫病(Alternariasola)ni分离法：组织分离或稀释平板法分离用培养基：WA培养(产孢)用培养基：V-8medium或PDA接种法：喷雾法(a)以无菌水配制孢子悬浮液(含0.5%Tween-80展着剂，有助于孢子悬浮)。(b)以喷雾

9、器将孢子喷于叶面上。(c)套袋保持高湿1-2天。(d)连续观察1-4周，并记录。(e) 以无菌水(含0.5%Tween-80展着剂)取代孢子悬浮液为对照。(9)十字花科蔬菜黑斑病(血brassicicola)分离法：组织分离法或稀释平板法分离用培养基：WA培养(产孢)用培养基：V-8medium保存用培养基：V-8或PDA接种法：喷雾接种法同蕃茄早疫病(10)十字花科蔬菜软腐病(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)分离法：划线平板法或稀释平板法分离用培养基:NA、PDA或CVPselectivemedium培养用培养基：NA或YDCmedium保存用培养基：NA

10、、YDC或无菌水接种法：穿刺法或注射法穿剌法同蕃茄癌肿病。注射法:(a)以灭菌注射筒将细菌悬浮液注入表面消毒的叶柄内。(b)套袋保持高温1天。(c)观察1-3天，记录病征后再分离。(d)以无菌水取代细菌悬浮液为对照。(11)黄瓜猝倒病(Pythiumaphanidermatum)分离法：组织分离法或诱钓法(分离时勿用chlorox表面消毒，仅以无菌水漂洗即可。分离用培养基：WA、茄子或黄瓜保存用培养基：PDA或无菌水接种法：土壤接种法(a)接种菌源之PDA、茄子或黄瓜，以果汁机打碎拌入灭菌的栽培用土壤中制成病土。(b) 黄瓜种子表面消毒，一部分催芽育苗，一部分阴干。(c) 将种子和幼苗直接植入

11、病土中。(d) 套袋保持高湿1-2天。(e) 连续观察1-2周，并记录病征。(f) 以未接种菌源之PDA、茄子或黄瓜拌入土中为对照。(12)黄瓜炭疽病(CoUetotrichumlagenarium)分离法：组织分离法分离用培养基：PDA保存用培养基：PDA接种法：喷雾法(同蕃茄早疫病和十字花科蔬菜黑腐病)(13)玉米锈病(Pucciniamaydisf.sp.polysora)分离法：(a)准备玉米幼苗数棵。(b)叶面以了70%酒精消毒后，以无菌水擦拭数次(动作宜轻柔，不要在叶面造成坏疽现像)。(c)以毛笔沾病斑上的夏孢子堆。(d)在消毒的叶面上来回刷数次。(e)套袋保持高湿1-2天。(f)

12、待叶片上出现夏孢子堆后，重复上述步骤1-2。(g)分离时亦可改用离叶法(detachedleavesmethod)取代全株植物进行。即切取玉米叶片，表面消毒后置入灭菌的温室(moistchamber)中，再接上述步骤3。分离、培养(产孢)、保存均使用玉米叶片(全株或叶)。接种法：同分离法，以毛笔沾无菌水为对照，但实验组与对照组要隔离，避免夏孢子掉落于对照组上引起病征。(14)柑桔绿霉病(Penicilliumdigitatum)分离法：划线平板法或稀释平板法。分离用培养基：WA培养(产孢)培养基：PDA保存用培养基：PDA接种法：（a）柑拮表面消毒后，阴干。（b）灭菌的牙签或移殖针，在部份柑桔

13、上穿剌造成伤口，另一部份柑桔则不造成伤口。（c）以棉花或毛笔沾取无菌水配制的孢子悬浮液，涂抹于柑桔表面和伤口上。（d）套袋保持高温1-2天。（e）连续观察病征1-2周，并记录。（f）以无菌水为对照。注意事项：（1）上述1-14项病害，完成科赫法则所需时间，短者2周，长者8周。（2）细菌培养日久将会死亡或病原性降低，因此接种前应先行移殖（transfer）,以新鲜菌落接种。（3）用于接种的健康株株龄会影响接种的成功与否。一般而言，幼苗较成株感病。（4）接种源浓度也影响接种的成功与否。若接种失败，可考虑提高接种源浓度。（5）接种部位与使用方法也影响接种效率。一般而言，接种部位与用以分离病原的组织部

14、位相同（萎凋病除外）。接种方法可用上述提供之法，亦可参考DhingraandSinclair.1985.Basicplantpathologymethod.CRCPress.书中第五章。（6）环境因子也会影响接种的效率。高湿度有助于病原菌之侵入，套袋可达此效果。但套袋不宜过久，且不应完全密闭造成缺氧状况。高温亦有助于发病。学会描述记录，发表文章就省力多了科赫法则试验范例丝瓜萎凋病实验人：苏俊峰英名：Fusariumwilt病原菌学名：F.oxysporumf.sp.luffaeKawai,Suzuki,andKawai寄主植物：白丝瓜(Luffacylindrica)病原菌生态：病原菌经单孢纯

15、化培养于PDA斜面培养基上，其生长特性为白色到粉白色的气生菌丝，并有橙色到黄橙色的色素产生，而菌丝体表面亦生有橙色到粉白色的菌核，或埋生的蓝紫到黑色的菌核。以土壤稀释平板法培养在PCNB培养基上，则菌丝生长缓慢，为白色到粉白色、细毛状、容易产孢，孢子褥(sporodochia)为橘红色，鲜少产生菌核，有橙黄色到黄白色的色素产生。于400倍显微镜下观察病原菌形态，其大孢子透明无色、壁薄而纤细，有足细胞与顶细胞，没有平行边，具1-4个隔膜，以3个隔膜为最普遍，大小为345.7xl9.0-56.7um；小孢子透明无色，卵圆形到肾脏形，单室或双室，大小1.9-5.7x3.8-17.1um；厚膜孢子球形

16、，表面平滑而壁厚，单一或成对，顶生或间生，亦可由大孢子产生，大小5.6-l5.2x6.0-l5.2um；菌核黑褐色或橙红到粉白色，球形到卵球形，大小0.12-0.54x0.12-0.63mm。将供试菌株Fol-114培养在PDA平板上，置于不同温度的定温箱中，培养7天后计算其菌丝生长速率(mm/day)，结果在49时菌丝不会生长，随着温度的增加，菌丝生长速率会随之增加，209时生长速率达到高峰，然后逐渐减缓，到409时菌丝不会生长。病征与病害生态：南投县埔里镇的水蛙窟和大坪顶等地区的农民，大都于二月上旬，将白丝瓜苗移植于本田。正常的移植苗于2星期内即长出新蔓，而患病苗在此期间则表现生长不良、叶

17、片伸展不开、植株矮化，或者根部与茎部维管束褐化后转黑褐化及植株一侧萎凋等病征，病苗于2周内快速死亡。初期未表现猝倒的植株，会有1至数条根系受害，中午蒸散作用旺盛时，有暂时萎凋的现象，进而叶片一侧黄化，茎部与维管束褐化及植株一侧萎凋，病株于一个月内死亡。随着三、四月气温逐渐回升，丝瓜快速生长，田间发病的情形会减缓。成株于初期仅有1-2条主根或部分支根的维管束黑褐化，再向茎部蔓延。每当褐化维管束向上越过一个茎节，褐化的维管束数目便会增多，约通过3-4个茎节后，茎蔓即表现半侧褐化，终至有外部“蔓割”的病征。在潮湿的环境下，尤其是下雨后，茎外表褐化或开裂处会有胶脂状的粘稠物泌出。患病株根系愈粗大，茎部

18、外表一侧褐化的病征也愈接近地基部，同时根系也会有一侧褐化的病征，而不长支、细根或已崩解。供试植物来源与栽培：供试丝瓜种子，包括购自农友种苗公司与生生种苗公司的圆筒型丝瓜(LuffacylindricaRoem.)；和中兴大学植病系土壤传播性作物病害研究室保存的圆筒型丝瓜等不同的栽培品种/系。另外由埔里丝瓜萎凋病患病田，收集赤崁顶白丝瓜种子；并从农家获得水蛙窟白丝瓜与旗山白丝瓜种子。在室温下(22-28C)以自来水冲洗供试种子12-24h催芽后，播植于盛有泥炭土(peatmoss,TKS1Instant)和珍珠石(perlite)混合物(3:1,v/v)的穴盘(50或60格海格直径4.5cm，深

19、4.5cm)中育苗，待幼苗长出2-3真叶后，移植于装有泥炭土的黑色软塑料盆(直径6cm，高6cm)备用。供试培养基:(1)2%水琼脂(2%wateragar,2%WA):取20g之洋菜粉(惠光公司)加入1,000ml蒸馏水中，以高压杀菌釜消毒20min(121C，1.2kg/cm2)，倒成平板，静置于实验桌上2-3天后备用。供病原菌分离用。(2)马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,PDA):切取去皮之马铃薯200g加1,000ml蒸馏水煮沸10min,取其过滤液，加入20g之洋菜粉(惠光公司)，再加入20g葡萄糖，并将最后体积调整为1,000ml，分装于500ml烧杯或每9

20、ml分装于试管(直径1.8cm、高17.8cm)中，经高压杀菌(121C,1.2kg/cm2)20min,倒成平板或摆成斜角30-45O之斜面培养基，静置于实验桌上2-3天后备用。供菌种保存与病原菌鉴定用。(3)五氯硝苯蛋白冻琼脂(quintozenepeptoneagar,PCNB培养基)：取1gKH2PO4、0.5gMgSO47H2O及20gDifcoBacto-agar加入1,000ml蒸馏水中，高压杀菌(1219,1.2kg/cm2)20min，待其冷却至90C时，迅速加入15g之peptone,并静置于55-60C之水浴槽中，待其温度平衡后，加入1gpentachloro-nitro

21、benzene(PCNB),再待其冷却至45C时，加入0.5gstreptomycin和0.1gneomycin，混合均匀后，倒成平板，静置于实验桌上2-3天后备用。供分离鉴定Fusariumspp.用。病原菌分离：(a)由患病组织分离：赴各地丝瓜田调查病害时，以小铲子挖取整株患病株(包含根部与根圈土壤),携回实验室以自来水冲洗干净后,观察其根系之病征表现,将已受病原菌侵害并表现病征者,称之为病根；而外表无任何病征者,称之为健根,然后进行病原菌分离。将清洗过的患病株,以消毒过的解剖刀,分别于病根与健根之细根、支根和主根部位,切下长度1cm之组织片段；茎部则视株高大小由茎基部开始到茎稍,每隔5c

22、m或10cm或20cm切下长度1cm之组织片段。若采回的植株,其地上部与地下部皆没有明显的病征表现,则以自来水冲洗干净后,逢机取10条根系,以消毒过的解剖刀,切下长度1cm之组织片段；茎部则视株高大小,由茎基部至茎稍,每隔5cm或10cm或20cm切下长度1cm之组织片段。将切下的组织片段放入95%酒精：5.25%次氯酸钠(1:1,v/v)混合液中做表面消毒5秒钟后,以清洁的卫生纸吸干消毒液,另以未经表面消毒者为对照组。将处理过的组织片段，置于2%水琼脂(wateragar,WA)培养基及五氯硝苯蛋白冻琼脂(quintozenepeptoneagar,PCNB)培养基中，置于适当光照(2支40

23、-watt的日光灯，距离30cm，每天12hr.光照)，室温(25-28C),或置于靠北边之窗台上，待菌丝长出后，切取单一菌丝尖端或单孢(single-sporedculture)，培养于马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,PDA)斜面培养基，置于适当光照(2支40-watt的日光灯，距离30cm，每天12hr.光照)，室温(25-28C)下培养备用。(b)由根圈土壤分离：携回实验室之丝瓜患病株根圈土壤,先置于室内(25-28C)阴干后，加以碾碎并均匀混合，逢机秤取1g土样加到9ml无菌水中，在振荡器(vortex-mixermodelVM-2000)上充分振荡搅拌后，以土

24、壤稀释平板法，将土样(稀释倍数10-2、10-3与10-4)涂抹在PCNB平板上，每个土样取3个小土样，每小土样各3个平板，置室温(25-28C)下，每天12hr.光照，或置于靠北边之窗台上，经5-7天后鉴定并读取丝瓜萎凋病菌菌落数目(propagules/gsoil)。(c)由丝瓜种子分离：由发病的丝瓜田中，收集赤崁顶白丝瓜种子，并逢机取出200粒种子，其中一半以95%酒精：5.25%次氯酸钠(1:1,v/v)混合液表面消毒10分钟，再以清洁的卫生纸吸干消毒液；另一半则不做表面消毒为对照组；处理后将种子移置于PCNB选择性培养基平板上，在室温(25-28C)下培养，观察与鉴定“白丝瓜”种子是

25、否带有丝瓜萎凋病菌。接种方法：(1)剪根接种法(Root-pruningmethod):在泥炭土：珍珠石(3:1,v/v)混合介质中培育的供试植株幼苗，生长至2-3片真叶时，将植株轻轻挖起，以自来水将根部漂洗干净，然后将培养在PDA斜面2-3星期的供试菌株，以9ml无菌水洗下孢子，连续2次，经两层消毒纱布过滤后，作成孢子悬浮液，并以无菌水调整其浓度约为1.0-5.0X105(spores/ml)。将供试植株幼苗根部浸泡在悬浮液中，同时剪断自根尖往上算起1/3-1/2长度的根部，持续浸泡10-20min后，将其盆栽于新鲜的珍珠石内(栽培盆直径为13cm),每处理5盆，每盆3株，置于温室中，并以温

26、湿度记录器(精德，Sato)记录每天温湿度变化，定期施用叶绿精植物营养液，观察病势发展。(2)土壤混菌法(Soilinfestationmethod):将供试菌株于PDA斜面培养2-3星期后，加入9ml无菌水洗下孢子，连续2次，作成孢子悬浮液浓度约为1.0-5.0x106(spores/ml)，混入实验室购买使用，不含丝瓜萎凋病病原菌的供试土壤(pH值6.5之壤土(Loam)，以下称温室土壤)，置于温室之植台上，定期搅拌均匀，7-11天后，利用土壤稀释平板法，以PCNB选择性培养基测其病原菌浓度，并以温室土壤调整其含菌量为1.0-5.0x10(propagules/gsoil)的供试混菌土(i

27、nfestedsoil)备用。培育的供试植株幼苗生长至2-3片真叶时，移植于盛有备用混菌土的栽培盆（直径为13cm）内，每处理5盆，每盆3株，置于温室中，定期施用叶绿精，并以温湿度记录仪记录每天温湿度变化，观察病势发展。病原菌保存：将纯化备用的菌株短期内，每隔20-30天，重新单孢培养于PDA斜面上，置于室温（25-28C）下，每天12hr.光照；长期保存则将培养在PDA斜面2-3星期的菌株，以无菌水做成孢子悬浮液，直接加入盛有经高温高压灭菌（121C,1.22Kg/cm，20min）的干燥砂质壤土的螺旋小试管（长4cm，内径1.2cm）内，置室内阴凉处备用；或将菌株单孢培养在PDA平板上，约3-4天后，切取菌落外缘的菌丝块，移入内含土壤水琼脂培养基（soil-agarmedium，10%loamysand，1%wateragar）的螺旋试管（长10cm、直径1.5cm）中，在室温（25-28C）下生长5-7天后，再以铝箔纸封住管口，分置室温（25-28C）与低温（4C）下存放。（冉炜根据台湾中兴大学植病系林益升等植物病理学讲义整理）