DNA重组技术的基本工具

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1、设想一 能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？胰岛素是治疗糖尿病的特效药,长期以来只能从猪、牛等动物的胰腺中提取，产量低成本高。而微生物生长迅速，容易控制。于是科学家设想，若能将人的胰岛素基因导入微生物体内，并得以表达，就不仅能解决产量问题，还能大大降低生产成本，使药品价格大幅下降。设想二 这些定向改造基因的设想能实现吗？基因工程基因工程抗虫棉抗虫棉蓝色玫瑰蓝色玫瑰能生产胰岛素的大肠杆菌能生产胰岛素的大肠杆菌 转基因鼠转基因鼠能发荧光的转基因猪能发荧光的转基因猪基因工程得以实现的理论基础：基因工程得以实现的理论基础：（1）所有生物）所有生物DNA的的化学组成化学组成和和结构结构相同。相同。（为不同

2、种生物（为不同种生物DNA拼接成功提供物质基础）拼接成功提供物质基础）（2）所有生物共用一套）所有生物共用一套遗传密码子遗传密码子。（为。（为某生物的基因能够在其他生物细胞内正常指某生物的基因能够在其他生物细胞内正常指导蛋白质合成提供可能。）导蛋白质合成提供可能。）都是以都是以4种脱氧核苷种脱氧核苷酸为基本单位酸为基本单位都是双螺旋结构都是双螺旋结构 抗虫棉的抗虫棉的培育有哪些培育有哪些关键步骤？关键步骤？DNA DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具本节知识内容本节知识内容 1 DNA1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题一专题一 基因工程基因工程“分子手术刀分子手术刀”限

3、制酶限制酶“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 黏性末端黏性末端平末端平末端12345脱氧核苷酸的结构脱氧核苷酸的结构 G1234512345 A3,5-磷磷酸二酯酸二酯键键3端5端3端5端磷酸二酯键磷酸二酯键18仔细观察各限制酶仔细观察各限制酶 识别的特定序列有识别的特定序列有何何 特点？特点？限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是呈现碱基互补对称，无论是6个个碱基还是碱基还是4个碱基，都可以找到个碱基，都可以找到一条一条中心轴线中心轴线，

4、中轴线两侧的，中轴线两侧的双链双链DNA上的碱基是上的碱基是反向对称反向对称重复重复排列的排列的，称为，称为回文序列回文序列中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条两条单链的切口，带有几个单链的切口，带有几个伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他们之间正好互补配他们之间正好互补配对，这样的切口叫对，这样的切口叫黏性末端黏性末端。SmaISmaI限制酶的切限制酶的切割割当限制酶从识别序列的

5、中心轴线处切开时，切开的当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNADNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。限制性内切酶作用过程SmaISmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G与C之间切割你能推测限制酶存在于原核生物中的你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？作用是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。制，以防

6、止外来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细就是细菌的一种菌的一种防御性工具，防御性工具，当外源当外源DNA侵入时，会侵入时，会利用限制酶利用限制酶将外源将外源DNA切割掉，切割掉，以保证自身的以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切切割外源割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的、使之失效，从而达到保护自身的目的。目的。寻根问底寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其的细胞，其DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶不具备这种限制酶的

7、识别切割序列的识别切割序列，或者，或者通过甲基化酶将甲通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的种限制酶也不会使自身的DNADNA被切断，并被切断，并且可以防止外源且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。基因的针线：基因的针线：DNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A

8、T T C G用同种限制酶切割用同种限制酶切割类型来源功能相同点差别EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第阅读课本第5页页“分子缝合针”DNA连接酶的相关内容，填写下表的相关内容，填写下表自主学习自主学习ATGCATGC连接酶连接磷酸二酯键连接酶连接磷酸二酯键DNADNA连接酶的作用过程连接酶的作用过程：二、分子缝合针二、分子缝合针DNA连接酶连接酶 T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A作用部位：作用部位：（扶手）（扶手）（梯子）（梯子）DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶有何连接酶有何相同点和

9、不同点？相同点和不同点？DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶连接连接DNA链链连接部位连接部位双链双链在两在两DNADNA片片断之间形成断之间形成磷酸二脂键磷酸二脂键单链单链将单个核苷酸加将单个核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片断片断33末端形成末端形成磷酸二脂键磷酸二脂键连接黏性末端连接黏性末端连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端分类分类作用作用E.coli DNA连接酶连接酶连接酶种类：连接酶种类：T4DNA连接酶连接酶核苷酸分子的连接：核苷酸分子的连接：ATGCATGCDNADNA聚合酶连接单链聚合酶连接单链DNADNA把单个脱氧核苷酸连接到把单个脱氧核苷酸连接到DNADNA片段

10、上片段上三、分子运输车三、分子运输车基因进入受基因进入受体细胞的载体体细胞的载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！细胞内去！能将外源基因送入受体细胞的工具能将外源基因送入受体细胞的工具就是就是载体载体。基因工程的载体被喻为基因工程的载体被喻为：分子运输车分子运输车基因工程的载体来源基因工程的载体来源：作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？有标记基因的存有标记基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别。素的培养

11、基鉴别。有切割位点有切割位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有）之外，并具有自我复制能力自我复制能力的很小的双链环状的很小的双链环状DNA分子。分子。最常用运载体最常用运载体质粒质粒 实际上在基因实际上在基因工程操作中，工程操作中，真正被用作载真正被用作载体的质粒，都体的质粒，都是在天然质粒是在天然质粒的基础上进行的基础上进行过人工改造的。过人工改造的。1 1、能自我复制、能自我复制2 2、具有一个或多个限制酶切点、具有一个或多个限制酶切点3 3

12、、具有遗传标记基因、具有遗传标记基因4 4、对受体细胞无害、易分离、对受体细胞无害、易分离5 5、大小适合，便于操作、大小适合，便于操作质粒作为运载体的条件？在进行基因工程操作中在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的天然质粒的基础上进行过人工改造的课本知识回顾课本知识回顾 基因工程又叫做基因工程又叫做 或或 。通俗地说，就。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物是按照人们的意愿，把一种生物的某种的某种 提取出来，加以提取出来，加以 ，然后然后放到另一种生物的细胞里，放到另一种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。改造生物的遗传性

13、状。基因拼接技术基因拼接技术DNA重组技术重组技术基因基因修饰改造修饰改造定向地定向地DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀”“分子缝合针分子缝合针”“分子运输车分子运输车”限制限制（性核酸内切）（性核酸内切）酶酶DNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键粘性末端粘性末端平末端平末端1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类连接黏性末端连接黏性末端Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键连接黏性末端和平末端连

14、接黏性末端和平末端通常有三种通常有三种:作为载体的条件：作为载体的条件：在进行基因工程操作中在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是真正被用作载体的质粒都是在在 质粒质粒噬菌体衍生物噬菌体衍生物动植物病毒动植物病毒天然质粒天然质粒人工改造人工改造的的能自我复制；有切割位点；能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离基础上进行过基础上进行过在基因工程中，切割运载体和在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的含有目的基因的DNA片段，需片段，需使用（使用（）A.同种限制酶同种限制酶 B.两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶 D.

15、两种连接酶两种连接酶比较有关的比较有关的DNA酶酶（1）DNA水解酶：能够将水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将解旋酶：能够将DNA或或DNA的某一段的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如旋酶以外，在适当的高温（如94）、重金属盐）、重金属盐的作用下，也可使的作用下，也可使DNA解旋。解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成酯键连接成DNA长链。长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。的缺口。