抗病原菌植物基因工程进展

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1、抗病原菌植物基因工程进展崔晓江彭学贤(中国科学院微生物研究所，北京1。80)摘要：植物病原菌给农林生产带来巨大的损失，植物基因工程在培育抗病原菌植物方面是传 统育种技术的补充和发展，短短几年，在抗细菌和抗真菌植物基因工程方面出现了一些全新 的成功策略，这些范例都是针对病原菌的生理结构、致病机理及与植物的相互关系。本文概 括论述了这些策略的基本思路并对其局限性加以探讨。随着植物病理学、植物分子生物学和 病原菌分子生物学的研究进展，新的抗性策略将会出现。关键词：病原菌，植物基因工程，毒素，酶1前言植物病原一直是农业生产的大敌之一，其严重侵染可造成农作物生产的巨大损失。一般，植 物在病原侵入的时候都

2、能调动自身的防卫体系从而显示一定的抗性。但是，在某些情况下， 如病原菌生理小种变异，环境状况的改变，大面积区域内作物品种长期单一化等都可造成植 物防卫机制的运转失灵，使病原菌侵入时能克服植物防卫体系的作用，从而导致植物大面积 死亡。1840年前后，在爱尔兰，晚疫病流行造成的马铃薯绝产，导致了饥荒，迫使成千上 万的人流落他乡。直到今天，真菌病害仍是世界范围内限制作物产量的重要因素之一。同样， 细菌病害也是长期以来困扰作物育种学家的难题之一，除了用硫酸铜治疗法尚无其它良策。 在林业生产上，病原菌的危害也不可轻视。育种工作的主要目标之一即培育抗病原菌作物， 传统的植物育种技术在这方面已取得很大的成绩

3、，但其缺点也显而易见，如周期长，可利用 的品种资源少，培育出来的抗性品种往往因病原菌生理小种的改变而变得易感病。基因工程 的兴起给植物育种注入了新鲜血液，基因工程育种超越了传统育种的界限，丰富了生物多样 性内涵，对我们了解植物本身的防卫机制提供了全新的研究手段。国内外不少实验室正致力 于用植物基因工程手段培育抗病原菌作物，而且已出现了一些成功的范例。这方面的进展有 可能使育种工作做到采用相同或类似的策略、路线去培育几十、上百种抗病原菌植物。2抗细菌植物基因工程大田作物、果树和萨菜都有一种或几种细菌病害，禾本科、豆科和茄科作物上的细菌病害比 较多。以马铃薯为例，细菌病造成的损产占全世界年产量的2

4、5%(约合40亿美元)1。长期 以来，人们一直在努力试图培育抗细菌作物，尤其是近几年，通过植物基因工程技术培育抗 细菌作物已经出现几种相当成功的策略;新的抗细菌路线正在尝试之中。2.1消除细菌毒素的毒性作用烟草丁香假单胞菌(p.syrzngaepv.tabaci)侵染烟草后可导致烟草野火病(wildfire)，其典型症 状为黄化。目前已弄清野火病的原因是该病原菌产生的一种毒害植物二肤形式的烟毒素 (tabtoxin)，该毒素在植物细胞内分解产生的件内酞胺能抑制烟草细胞中的谷氨酞胺合成酶 (glu-taminesynthetase话性，导致烟草细胞中NH4+的非正常积累。P.syringae p

5、v.tabaci基因组 本身编码一种乙酞转移酶，可使tabtoxin或0内乙酰胺乙酰化，从而解除烟毒素对自身的毒 性作用，该菌因而对自身产生的毒素不敏感。日本科学家2克隆了 P.syringae pv.tabaci的乙 酰转移酶基因，将其置于CaMV35S启动子控制之下，由农杆菌介导转化烟草，最终获得了 n株不同程度抗烟毒素的转基因烟草，其叶片能在含烟毒素的培养基上诱导形成愈伤组织。 用107病原菌/ml的浓度接种，5株转基因烟草没有表现病症，而对照株发病。用107原菌/ml 的浓度接种，外源基因表达水平最高的一株几乎不发病。这说明了表达病原菌乙酰转移酶基 因的烟草对烟毒素的毒害及P.syri

6、ngae pv.tabaci的感染均具抗性。2.2引入对细菌毒素不敏感的靶酶菜豆丁香假单胞菌P.syringae pv.phaseolicola产生的一种三肽形式的云扁豆蛋白毒素(Phaseolotoxin)是菜豆的晕疫病(haloblight)的成因，其致病机理是该毒素在植物细胞内分解产 生的鸟氨酸类似物抑制了定位于植物细胞叶绿体中参予氨基酸合成的鸟氨酸氨甲酸转移酶 (or-nithinecarbamoyltransferase, ocTase)的活性，而 P.syringae pv.phaseolicola基因组编码抗云 扁豆蛋白毒素的OCTase，使细菌本身免受毒素的毒害作用。墨西哥科学

7、家s将细菌的OCTase基因与1，5 一二磷酸核酮糖梭化酶Rubisco小亚基的转导 肽编码序列融合，将其置于CaMV35S启动子控制下，由农杆菌介导转化烟草，在转基因烟 草中，细菌OCTase基因的表达产物定位于植物叶绿体中，且为活性形式。用P.syringaepv.phaseolicola接种非转基因烟草，出现了黄化水样侵蚀斑，其中一些发生系统 感染，生长停止，最后死亡。接种转基因烟草就没有上述症状，仅初期出现小的坏死斑，以 后发展为大的死细胞区，这表明转基因烟草不易发生系统感染，且能产生过敏性保护反应。 若用毒素直接处理烟草叶面，对照株出现黄化圈，转基因植株无此症状。但因p.:y二ga沦

8、 Pv.Phaseolic碗感染植物引起的症状中只有黄化圈、系统退绿和系统感染与该毒素有关，其 它症状并不受该毒素控制，所以这种策略不能完全消除该病原菌的致病力。2.3增强植物本身的防卫蛋白合成硫堇(thionin)是一类在植物种子胚乳中广泛存在的由4547个氨基酸组成的高等植物防卫相 关蛋白，偏咸性，富含半胧氨酸，除了作为贮藏蛋白外，体外实验还表明，小麦a1 一 thionin 和大麦胚乳a-thionin对植物病原菌如P.syringae pv.tabaci153也具有生长抑制作用。近年来， 在大麦的叶子中也发现了硫荃，它们主要分布于表皮细胞层的细胞壁中。硫荃的基因组序列 含两个内含子。西

9、班牙科学家5将小麦al 一 thioninCDNA与大麦a 一 thionin基因组DNA分别置于CaMV355 启动子控制下并转化了烟草，对转基因烟草的Northern和western分析表明，大麦a 一 thionin 基因中的两个内含子在转录后被正确切割，且大麦a 一 thionin的表达量大大高于小麦。1 一 thionin，转大麦a-thionin基因烟草的叶子粗提蛋白在体外可抑制马铃薯环腐病病原菌密 执安棒杆菌(claribactermichiganense)的生长。用病原菌 P.syringae pv.tabaci 和 P.syringae pv. syringae接种后发现，对

10、照株70%以上发生坏死侵蚀斑，而转大麦a-thionin基因的烟草的发 病率和发病程度明显低于对照，且抗性强弱与外源thionin基因的表达量成正比。转小麦a1 一 thionin基因的烟草由于表达水平低，抗性不明显。可见外源thionin基因的高表达能增强 转基因植株(烟草)对病原菌的抗性。2.4裂解细菌细胞壁该策略是将原核或真核生物的溶菌酶基因导入植物，通过植物细胞表达外源溶菌酶破坏细菌 细胞壁，从而达到抗菌目的。T4噬菌体溶菌酶是同类酶中活性最强的溶菌酶之一，对革兰氏阴、阳性菌均有效。德国科 学家KlausD盯ing等困将大麦a 一淀粉酶信号肤编码序列与T4噬菌体溶菌酶基因融合并置 于C

11、aMv35s启动子的控制下，以使表达的T4噬菌体溶菌酶分泌到植物细胞外，在病原菌侵 染早期就杀灭之。构建的植物表达载体通过农杆菌介导转化马铃薯，获得了一批转基因植株。 Southern杂交发现所有转基因植株均含一个拷贝的外源T4溶菌酶基因，Westem杂交表明 T4溶菌酶的表达量很低。用马铃薯黑胫病、软腐病的致病菌胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotov0ra atroseptica)接种转 基因马铃薯，采用块茎盘分析法(tuberdiscassay)进行抗菌试验。通常，在湿润条件下，22C 时，小于100个细菌即可引起侵蚀斑，若接种量为25000个细菌(10 20闪)，从第二天起，

12、 对照马铃薯出现水浸现象(maceration)，到12天时上升至100%，而所有转基因株系平均只 有60%发病，最低为30%。若接种细菌于含一个芽眼的块茎片，观察发芽率。22天后，对 照马铃薯为。20%，而转基因马铃薯株系即使接种量高，30 一 100%的块茎片也还能发芽， 且发芽后的植株健康生长，所收获的块茎也无病症，而对照植株外观不健康。考虑到病原细菌寄生于植物细胞间隙，T4溶菌酶通过大麦a 一淀粉酶信号肽引导而定位于 细胞壁外，其抗性效果会优于定位于细胞内的溶菌酶，但蛋白在分泌过程中可能被糖基化， 从而影响酶的活性。研究表明，转基因马铃薯内的T4溶菌酶确实在外泌过程中被糖基化了， 但活

13、性未受影响。这可能是因为糖基化位点(第140位的Asn)位于蛋白表面，糖基朝向离开 酶活性中心(第n位的Glu和第20位的AsP)的一面，也即远离酶活性中心。采用针对细菌细胞壁的策略有广谱性的优点，但因所有植物细菌的细胞壁结构基本一致，若 要使溶菌酶不影响转基因植物非病原共生细菌，采用病原诱导型启动子调控溶菌酶合成更 佳。我们实验室将T4噬菌体溶菌酶基因和分泌至胞外的烟草病原相关蛋白PRlb的信号肽编码 序列融合，置于增强的CaMV35S启动子控制下转化了烟草，转基因植株的抗菌试验正在进 行之中。另外，我们正探索将针对某种植物病原细菌的抗体基因与溶菌酶基因融合，以增加 溶菌酶接触病原菌的机会，

14、从而更有效地杀死病原菌。已有报道显示，表达牛溶菌酶的转基 因烟草对P.syringae pv.tabaci也有一定的抗性。表达鸡溶菌酶的转基因马铃薯也已获得，抗 性试验正在进行之中。2.5破坏细菌细胞膜该策略是将抗菌肽(CecroPins)的基因导入植物，通过植物细胞表达抗菌肤破坏细菌细胞膜， 达到抗菌目的。抗菌肤是昆虫分泌的一类病原细菌诱导产生的存在于血淋巴中的蛋白。天然抗菌肤N端为 强碱性，C端为中性且包含长的疏水区，N端能形成亲水脂a一螺旋，即在柱形分子纵切面 一侧为带电基团，而在相反一侧为疏水侧链，具有这种结构的蛋白质常与膜联系。抗菌肤所 以具有抗菌活性，是因为能与原核生物的细胞膜相互

15、作用，导致膜的破坏，细菌因此无法保 持正常的渗透压而裂解。抗菌肽一般含3537个氨基酸，抗菌谱很广，对革兰氏阴、阳性细 菌均有效川。科学家通过对天然抗菌肤的氨基酸序列进行定点改造研究，获得了抗菌性能更 好的抗菌肤的人工衍生物，如从Hyalophora cecropia的抗菌肤B经深入研究，衍生出shiva 一 I、sB 37等新型抗菌蛋白。据国外报导，Shiva 一 I基因如果置于一种受伤诱导启动子(Proteinaseinhibitor1promoter控 制下并导入烟草后，再接种青枯假单胞菌(P.solanacearum)，转基因植株症状延缓出现且程度 减轻，死亡率降低。此外，抗菌肤基因转

16、化马铃薯的工作也有了初步结果，转基因马铃薯明 显抗软腐病和黑胫病，在一定程度上减轻了水浸症状川。考虑到细菌寄生于植物细胞间隙， Nordeen等将大麦a 一淀粉酶信号肤编码序列与cecroPn基因融合，转化了烟草，抗性试验 正在进行之中。同样，该策略也具有广谱性优点，但要不影响植物有益共生细菌，应要用病 原菌诱导型启动子。我们实验室将Shiva 一 I基因和分泌到胞外的烟草病原相关蛋白PRlb的信号肤编码序列融 合，转化了烟草和马铃薯，目前正对转基因植株进行抗菌试验。2.6其它植物抗病性遗传分析的著名理论“基因对基因学说”认为在寄主一寄生物体系中，寄主体内 某显性抗性基因的抗性只有当同时存在某

17、生理小种的、与抗性基因互补的显性的无毒力基因 (avir-ulencegene)的表达，才能表现出来。近年来，根据该理论，利用基因工程技术，结合 微生物转座子标记技术以及无毒力基因转移后检测其功能的方法，对一些重要的植物病原细 菌致病性基因和无毒力基因的分析有较大进展，如Xanthomonas comPestris Pv.malyacearum 和Xanthomonas comPestris Pv.oryzae等，对这些病原菌的致病性基因或无毒力基因的数量、 定位、分离、克隆、结构、功能等都有了较多的了解。无疑，这些基本知识有助于进一步在 分子水平上了解鉴别小种，阐明致病性的分子机理及病原菌与

18、寄主的相互作用，甚至有可能 利用无毒力基因及其产物追踪分离寄主抗性基因。相比之下，用类似技术路线对寄主抗性基因的研究进展不理想，随着RFLP法(DNA限制性片 段长度多态性)、染色体步行法(chromosomewalking)、植物转座子标记法等分子生物学方法 的成熟与运用，估计几年后在克隆寄主抗性基因方面会有所突破。对上述几个策略的研究，可从中受到几点启发:要增强转基因植株对细菌的抗性，应该提 高外源抗细菌蛋白的表达水平，这可以从增强转录、翻译的角度入手。为了防止细菌产生 变异，导致对抗菌蛋白的抗性，同时也为了保护植物的有益共生细菌，外源蛋白的表达最好 采用诱导型，而非组成型。新近研究表明，

19、抗菌肤不但对原核生物有毒害作用，而且对简单 真核生物如酵母、原生动物也有毒害作用。虽然高等植物细胞对抗菌肤的耐受能力比细菌强 十几倍到几十倍，但也是有限度的。所以诱导型表达也有利于保护植物细胞本身。可惜目前 为止，分离的病原物诱导型启动子的表达强度和诱导速度都不够理想。植物病原菌一般寄 生于细胞间隙，因而通过信号肤将具有杀菌作用的蛋白分泌至植物细胞外有利于在病原菌侵 染早期杀灭之。细胞壁和细胞膜是细菌的两个基本结构，破坏这些结构的蛋白能直接杀死 细菌，且广谱性好，而目前的其它策略只是针对某一特定致病菌或抑菌能力不够强。考虑到 溶菌酶和抗菌肤的协同作用可能会增强杀菌效果，我们实验室将shiva

20、一 I基因和T7噬菌体 溶菌酶基因分别和烟草病原相关蛋白PRlb的信号肤编码序列融合，构建成双价植物表达载 体，转化了烟草，希望在细菌侵染烟草早期就杀灭之，同时我们在探索采用病原菌诱导型启 动子。相信在不久的将来会出现新的抗细菌策略。3抗真菌植物基因工程真菌病害是造成农林生产损失的主要因素之一，每年全世界都要施用大量的农药以防止真菌 病害的蔓延，即使如此，病原真菌的侵染仍造成农作物的大量减产。据统计，每年欧洲小麦 生产因真菌病害而损失约1亿美元。长期以来，各国农业育种专家都在努力培育抗真菌作物， 但由于病原小种的变异和环境气候条件的变化，使得培育出来的品种抗性退化快，推广也受 到影响。近年来，

21、由于化学农药对人类健康和其它生物的不良影响，各国都在尽量减少农药 的用量，开发更安全的农药，以保护环境，同时寻求对人、环境相对无害的解决方法对付真 菌病。80年代发展起的植物基因工程作为一种不同于传统育种技术的手段在抗真菌作物培 育方面崭露头角，已显示了诱人的前景。3.1裂解真菌细胞壁几丁质(聚8 -1，4 一 N 一乙酞葡萄糖胺)和8 -1，3 一葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成 分。几丁质在植物中不存在，卜1，3 一葡聚糖只存在于某些植物的初生细胞壁中。体外实 验表明，几丁质水解酶，特别是在件1，3 一葡聚糖酶的共同作用下，可抑制真菌的生长。 通常情况下，这两种酶在植物中表达水平很低，病

22、原菌侵染时，它们作为防卫蛋白受诱导高 表达。两者都具有酸性和碱性的同工酶，前者分泌到细胞壁间，后者积聚在液泡中。美国科学家Broglie等将一种菜豆液泡几丁质水解酶基因和caMv355启动子嵌合并导入烟草， 表达该几丁质水解酶的转基因烟草在生长和发育方面与对照株无区别。将转基因烟草栽种在 含立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的土壤里，测试对这种侵染玉米、大豆等农作物的真菌的抗 性，结果发现转基因烟草对这种真菌的抗性比对照株强，而且外源几丁质水解酶的表达量越 高，抗性越强。用分离提取的这种菜豆几丁质水解酶在体外实验中也能抑制真菌的生长。但 是，将烟草液泡几丁质水解酶基因导入烟草同

23、属植物(Nicotiana sylvestris)中并没有明显增强 对烟草尾抱(Cercos Poranicotianae)的抗性，很可能几丁质水解酶并不是植物防卫体系中决定 对烟草尾抱抗性的主要因素。类拟地，在烟草细胞中表达某种细菌(S.rcescens)的几丁质水 解酶也使转基因烟草表现出对立枯丝核菌有一定的抗性。目前也获得了转葡聚糖酶基因的烟草，抗性结果还未见报道。根据体外实验结果推断，在植 物细胞中同时表达外源几丁质水解酶和葡聚糖酶可能比单表达一种酶效果强。考虑到植物本 身存在多种这两种酶的同工酶，到底选择哪一种几丁质水解酶或葡聚糖酶对抗性结果必然会 产生不同影响。另外，高等真菌细胞壁

24、几丁质含量比低等真菌少，修复自身细胞壁的能力也 较强，所以策略也有局限性，最好和其它策略结合起来运用。3.2干扰真菌蛋白质合成核糖体失活蛋白(RIP)，如大麦和小麦种子中的RIP、蓖麻毒蛋白A链等，都属于一类特殊的 RNAN 一糖苷酶型，能水解真核细胞核糖体28SrRNA上某一位碱基的N 一 C糖苷键，释放一 个碱基，从而阻碍蛋白质的合成。RIPs不作用于自身的核糖体，只识别亲缘关系较远的真核 生物，包括真菌。提纯的大麦RIP在体外能抑制真菌的生长。将大麦RIPcDNA基因置于一种 受伤诱导的启动子控制下，转化烟草，把转基因烟草和对照植株栽种在感染立枯丝核菌的土 壤里，比较两者的生长高度，初步

25、发现外源RIP附于转基因烟草对该菌一定的抗性l，对 真菌生长的抑制等其它直接实验证据还未见报道。这种受伤诱导的启动子在花粉和花器官中 也能表达，但未发现转基因植株的不育现象，换用CaMV355启动子，转基因植株仍表现正 常，但这仅说明大麦RIP对烟草细胞无毒性，是否能将RIPs应用于其它农作物抗真菌感染依 赖于该RIP是否对其它农作物有细胞毒性。不同来源的RIPs对特定的异源核糖体合成蛋白质 的功能抑制程度不一样。当然，采用诱导型启动子生物多样性将RIPs分泌到胞外或液泡中 的策略可能减轻其细胞毒性。体外实验表明，RIPs和几丁质水解酶共同作用能大大增强RIPs 杀灭真菌的作用，5，这可能是因

26、为真菌细胞壁的破坏有助于RIPs进入真菌细胞内。3.3增加防卫蛋白的合成(表达外源植物抗毒素)植物抗毒素(phytoalexin)是一类当植物受病原微生物侵染而新合成的具有抗微生物活性的低 分子量化合物，如类黄酮(flavonoid)和类菇(terpenoid)等，催化其代谢反应的关键酶也被视为 防卫蛋白。不同种植物产生不同的抗毒素，病原菌对非寄主来源的抗毒素耐受性较差，即去 毒素毒性能力差。所以，设法在植物中合成异源抗毒素不失为一种有吸引力的抗真菌策略。 葡萄藤等几种植物能利用二苯乙烯合成酶(stilbenesynthase)合成一种1，2 一二苯乙烯类的抗 毒素三烃基二苯乙烯(resver

27、atrol)，利用的底物和苯基苯乙烯酮合成酶(CHS)的相同。德国科 学家l6将葡萄藤的二苯乙烯合成酶基因，连同自身的启动子导入烟草，在转基因植株的叶 片上接种灰葡萄抱(Botrytiscinerea)，发现有些转基因烟草增强了对该菌的抗性，引入的启动 子在烟草也能被诱导表达，外源抗毒素被诱导合成的速度越快，抗性也越强。提取转基因烟 草中的异源抗毒素做体外实验，采用烟草细胞中的浓度也能抑制真菌的生长。随着对植物抗 毒素的代谢途径、抑菌机理的研究深入，抗毒素在抗真菌应用方面会得到进一步的推广。3.4解除真菌毒素的毒性作用有些真菌能产生对植物细胞有毒害作用的毒素，如导致玉米枯萎病的真菌能产生一种杀

28、死被 感染植物细胞的毒素，美国科学家Briggs等克隆了一个使玉米抵抗枯萎病的基因，研究表明， 该基因编码一种酶，能破坏枯萎病真菌产生的毒素。该策略成功的基础在于对真菌毒素的分 子结构和致病机理的阐明，有些病原真菌并不产生毒素或不以毒素作为主要致病因子，这时 不应采用该策略。3.5破坏真菌细胞膜同时破坏真菌的细胞壁和细胞膜，可能会更有效地杀死真菌，这也是人们正在探索的抗真菌 策略之一。美国科学家在玉米种子内发现了一类22kDa的抗真菌蛋白 8，研究表明， 其抗菌机理在于能在真菌细胞膜上穿孔，导致真菌迅速死亡。在几丁质合成酶抑制剂日光霉 素(nikkomycin)存在下，其杀菌浓度可大大降低。在

29、燕麦、小麦等种子内也发现了类似的蛋 白。体外实验发现，抗菌肤ce-eropins在较高浓度下也能杀死真菌月。要使这些蛋白在转 基因植物中达到体外抑菌的浓度几乎是不可能的，但可考虑将这些蛋白分泌到植物细胞外， 与几丁质酶、葡聚糖酶等协同作用杀死真菌。3.6其它各国科学家目前都在尝试各类抗真菌策略。已有报道证明，将能破坏抱子的渗透蛋白(osmotin)基因导入悬浮植物细胞，能使转化细胞免受马铃薯晚疫病菌(phytoPhthora in festans) 的损害。将烟草PR 一 1蛋白基因转化烟草，能延迟烟草霜霉(peronos pora tabacina)引起的病 症的发展。德国科学家发现玉米产生

30、的针对玉米钻心虫的毒素对真菌也有一定的致死作用。 属植物防卫蛋白类的外凝集素(lectin)通过与几丁质的结合能抑制真菌的生长。真菌本身的代 谢、遗传机理较细菌复杂，和植物的相互关系也远未弄清，随着植物、真菌分子生物学和植 物病理学的发展，新的抗真菌策略将会出现。4结束语植物病原菌除了细菌、真菌外，还有对果树、林业生产造成极大危害的类细菌(BLO)、类菌 原体(MLO)等，对其分子生物学、病理学的研究起步较晚，到目前为止，还未出现针对这些 病原菌的植物基因工程策略。抗细菌、抗真菌基因工程也还未达到大田推广阶段，仍处于实 验室、温室或小规模试验田的研究阶段。要想真正让抗病原菌植物基因工程为农林生产做出 贡献，还需要分子生物学家、植物病理学家、育种学家等密切合作，共同努力。参考文献