医学专题：细胞破碎技术的研究与进展

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1、合 肥 学 院Hefei University生物分离工程课程综述题 目: 细胞破碎技术的研究与进展 系 别: 专 业: 学 号: 姓 名: 2013年4月 1日 细胞破碎技术的研究与进展摘要：本文主要概述细胞破碎方法中的高压匀浆法和珠磨法, 讨论了两种方法的特点及存在的问题, 并对它们进行了比较, 最后概括了细胞破碎技术的发展方向。关键词：细胞破碎技术；高压匀浆法；珠磨法；发展方向 1引言：自年代初重组技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃, 生物产品的数量越来越多，许多具有重大应用价值的产品应运而生，如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一等, 它们的基因分别在宿主

2、细胞如（大肠杆菌或酵母细胞）内克隆表达成为基因工程产物，从而提高了产量，降低了成本。很多基因工程产物都是胞内物质如上述药物经克隆表达后都属胞内物质，分离提取这类产物时，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤，破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。2 细胞破碎技术的概述：细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。目前已发展了多种细胞破碎方法，

3、以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。细胞的机械破碎主要有高压匀浆法、珠磨法、撞击破碎法和超声波破碎法等方法，本文主要介绍高压匀浆法和珠磨法。3 高压匀浆法：高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，高压匀浆器是该法所采用的设备，它由高压泵和匀浆阀组成。它是利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然简压和高速冲击撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放。3.1破碎机理同所有的机械破碎方式一样，高压匀浆法破碎细胞实质上是将细胞壁和膜撕裂，靠胞内的渗透压使其内含物全

4、部释放出来。破碎的难易程度无疑由细胞壁的机械强度决定，而细胞壁的机械强度则由微生物的形态和生理状态决定。因此细胞的培养条件, 包括培养基限制型或复合型、生长期对数期、静止期、稀释率等, 都对细胞破碎有影响胞内物质的释放快慢则由内含物在胞内的位置决定，胞间质的释出先于胞内质，而膜结合酶加最难释放。3.2影响因素影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数。人们普遍关心的是活性物质在破碎过程中的失活问题，研究表明蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起的。如果能将温度控制在35以下，那么酶活损失可以忽略。对于温度敏感性物质, 低温操作是必需的。高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往

5、往进行级间冷却。尽管提高压力有利于细胞破碎，但是提高压力需增加能耗，同时为移走产生的热量需要付出代价。高压匀浆法的能耗主要包括提供动力如压力消耗的能量以及低温操作耗费的能量。此外，操作压力对细胞破碎的影响要比匀浆次数的影响大得多。从提高破碎效率的角度应选择尽可能高的压力；而从降低能耗及延长设备寿命的角度应避免很高的压力。因此，工业生产中常采用的压力为5570Mpa。3.3存在问题 除了较易造成堵塞的团状或丝状真菌以及较小的革兰氏阳性菌不适于用高压匀浆器处理以外, 其它微生物细胞都可以用高压匀浆法破碎。另外有些亚细胞器如包含体，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。但最近也有人在实验室尝试

6、用高压匀浆器破碎真菌和含有包含体的大肠杆菌。4 珠磨法：珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。球磨破碎细胞的破碎率可高达95%，用于提取细胞壁，线粒体，核酸，蛋白以及其它细胞器的收率也高。用Dyno mill破碎酵母细胞提取线粒体的收率要比其它机械破碎法要高5-8倍。球磨破碎细胞应用范围广，从实验室到大规模生产均可使用，并可控制系统及破碎工艺过程的温度；操作系统密闭，可对系统进行灭菌，避免污染。因此，该技术和设备的发展和应用受到广泛关注。4.1破碎机理高速珠磨法也是一种有效的细胞破碎方法，珠磨机是该法所用的设备。微生物细胞悬浮液与

7、极细的研磨剂通常是直径的无铅玻璃珠在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞壁破裂,释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。4.2相关设备4.2.1球磨容器实验室规模的容积为0.15、0.3和0.6升，工业规模的为1.4升到15升，最大的可达265升，为带有冷却夹套的圆桶容器，小型的实验室使用的是无铅玻璃制造，而大型的是不锈钢制造。有通向容器内部的菌悬液进料口和球磨剂装料口。依靠夹具将其固定，很容易更换。4.2.2驱动马达 驱动马达为三相380 V，1.85 KW，2900 rpm

8、的电动马达。其主动轮通过一个特殊的V型皮带与搅动轴上的被动轮连结，利用安装在操作马达开关板上的手柄，控制皮带在主动轮和被动轮上的位置，改变搅动速度。分别达到2000，3000，4500和6000转/秒，这时的搅拌叶的线速度分别为6.7，10，15和20米/秒。4.2.3电动马达的控制控制马达的开关有两个按钮，开和关，安培表，信号灯，在防护罩上有磁性开关，一当防护罩打开，或在操作时未关上，电动马达不能启动。4.2.4搅拌叶由聚氨酯或不锈钢制造的直径为64毫米的圆盘，它们是用垫片和分离子按一定间隔距离将其固定在搅动轴上。4.2.5分离器为一种高效狭缝分离器，它的作用是将研磨剂保留在研磨容器内，而使

9、破碎的细胞悬浮液流出。狭缝的宽度是利用不同厚度的标准隔片控制，分别为0.02，0.05，0.1，0.2和0.3 mm。狭缝大小的选择取决于使用的研磨剂的粒度，一般为研磨剂直径的三分之一。4.2.6球磨剂 球磨剂为无铅玻璃制造的玻璃珠，直径范围最小的为0.1mm，最大的为1.5mm，可根据破碎的细胞种类进行选择。实验结果表明在球磨容器内的球磨剂装量为研磨容器的容积的80-85%为宜。 4.2.7给料泵为了连续破碎，可使用能调速的普通蠕动泵，将细胞悬浮液连续输到破碎器内，其供料速度可由需要的破碎率来控制。4.2.8冷冻设备由于在细胞破碎过程中高速搅拌，研磨剂与研磨剂，研磨剂与细胞之间的磨擦会产生大

10、量热量，破碎过程温度不断升高，为避免生物活性物质失活，对破碎系统进行冷却是十分必需的。对于Dtno-mill KDL可配用DMK 15/F型的循环流动式制冷机，对球磨容器和细胞悬浮液储存器进行冷却。4.3影响因素4.3.1细胞种类及状态利用Dyno-mill KDL进行的细胞破碎试验表明，不同中属的微生物细胞在相同条件下破碎时，其破碎效率有明显差异。差异的主要原因是不同种属的微生物细胞的大小和形态，细胞壁或膜的结构不同，另外，因生长条件如培养温度，时间，营养成份不同使上述的细胞形态细胞壁结构等也有差别。因此，即使在相同的破碎条件下其破碎效果也不同。换句话说，不同种属的微生物细胞所需的破碎条件也

11、不相同。从大量文献中可以总结出这样的规律：按细胞破碎的难易程度是细菌酵母真菌藻类。4.3.2细胞浓度在细胞破碎前，需用适当的介质，比如缓冲液按细胞重量配制成一定细胞浓度的悬浮液。悬浮液要均匀，要防止有结块和沉淀。一级反应动力学的速成常数应当与细胞浓度无关，但在较高细胞浓度下，破碎过程细胞内含物不断释放使系统粘度不断升高，混合速度降低，导致破碎速率下降。在高细胞浓度下，最大蛋白质释放量(Rm)降低，但破碎率高。低细胞浓度下，细胞的总蛋白质释放量高，并受流出速度影响较小；高细胞浓度下，细胞的总蛋白质释放量降低，特别是在高流出速度下，总蛋白质释放量随细胞浓度增加而下降。除了细胞浓度直接影响破碎物的粘

12、度以外，细胞的保存状态也影响着粘度和破碎率。细胞破碎过程中，由于粘度增加，热传导能力降低，即使在相同的冷却条件下，破碎系统的温度也会增高，温度的增高会引起蛋白质和酶变性，使蛋白质和酶的总释放量降低。总之，在Dyno-mill上进行细胞破碎，细胞浓度从20%增加到40%，破碎速度常数仅有很小的变化;细胞浓度增加到50%，破碎速度常数减小，破碎效率降低。高细胞浓度下，还会发生细胞破碎物沉淀和蛋白质沉淀现象一般来说，破碎细胞浓度以40%为宜。 4.3.3球磨剂 最常使用的球磨剂是无铅玻璃珠，其它的还有不锈钢珠，聚酯和聚酰胺珠等。4.3.3.1 球磨剂颗粒大小的影响一般使用的无铅玻璃珠的直径为0.11

13、.5 mm，利用大肠杆菌和酵母细胞进行实验发现，细胞破碎率随玻璃珠直径的增加而降低。对于不同的细胞，由于其大小不同，使用的玻璃珠的最适直径也不同。大肠杆菌和阴沟肠杆菌使用0.1 mm的玻璃珠进行破碎的效率最高；而酵母细胞使用0.250.5 mm的研磨剂最宜。实际操作时，一般不使用0.1 mm的球磨剂，即使破碎细菌也使用0.250.5 mm的玻璃珠。其原因有三：一、用0.1 mm的玻璃珠破碎速度虽高，时间短，若破碎时间控制不严，对酶有破坏作用，破碎物的酶活会下降；二、小珠机械研磨产生热量高；三、选择狭缝分离器时，狭缝的大小应当是使用的研磨剂直径的三分之一，使用0.1 mm的玻璃珠，狭缝应选用0.

14、03 mm的，这样的狭缝分离很慢，大规模破碎时很困难。玻璃珠作球磨剂，使用100 h的损失不超过3%，一年后检查分离器通道无重大变化，说明玻璃珠可以长期反复使用。还发现使用的玻璃珠大小与酶在细胞内的位置及细胞浓度有关。 4.3.3.2装量的影响 使用无铅玻璃珠作球磨剂，一般的装量为研磨容器容积的8085%。随球磨剂装量的降低，细胞破碎效率也降低，同时研磨过程中产生的热量也减少。因此，如果破碎释放的活性物质不耐热，而且设备冷却又差，需适当减少球磨剂的装量。另外，若细胞悬浮液或破碎物的粘度很高时，也需适当降低球磨剂的装量。4.3.4搅动速度 Dyno-mill 的搅动轴有四个转速，即2000，30

15、00，4500和6000 r/min，相应的搅拌叶轮的线速度为6.9，10，15和20 m/s。在球磨细胞破碎过程中，马达驱动轴带动搅拌叶转动是细胞破碎的维一能量来源。因此，搅拌叶的转速决定着细胞破碎的速度和程度。大多数试验证明，细胞破碎速率随搅拌叶转速的增加而增加，但在很高的转速下细胞破碎速率不会成比例增加，有时还可能下降。4.3.5叶轮结构经常使用的搅动叶轮有两种，一种是由聚氨基甲酸酯材料制造，具有开放式的结构；另一种是用不锈钢制造的，结构上不如聚氨基甲酸酯的开放。不同材质和结构的搅动叶轮在操作中因搅动效果的差异，使破碎系统的温度变化也不同。在低转速下，较开放的聚氨酯叶轮的破碎效率较低，这

16、是由于反逆作用所造成的。在高转速下，有较高的搅动效率，且能耗也增加。为增加搅动效率，可以使搅拌叶安装成与轴有一定角度，其作用是增加分散能力，但这样会使连续破碎的能力减小；因增加了能量到细胞悬浮液中的传递能力，而有较高的破碎速度，但能量效率降低，特别是在高转速下。4.3.6流速细胞破碎与搅动速度有关,在高搅动速度下，流速的变化对细胞破碎率影响较小，而在低的搅动速度下，流速对破碎率的影响较大。4.3.7温度目前还没有温度对破碎过程影响的详细研究报告，由于破碎为产热过程，直接影响破碎物的粘度及酶的活性和蛋白质总量的释放，一般来说，破碎温度越高，细胞蛋白质的释放量越低。5 两种方式的比较： 高压匀浆法

17、同高速珠磨法相比各有特点, 间歇处理少量样品时, 匀浆法优于珠磨法。前者操作参数少, 易于确定,而且样品损失量少, 最少可处理20ml悬浮液。珠磨机操作参数多, 一般凭经验估计, 并且珠子之间的液体损失使一次处理悬浮液最终只能得到左右的浆液。连续操作时珠磨机显示出优越性, 首先它兼具破碎和冷却双重功能, 减少了产物失活的可能性, 而高压匀浆器需配备换热器进行级间冷却其次珠磨法破碎效率高, 在适当条件下一次操作就能达到较高的破碎率, 而高压匀浆法往往需循环一次才行再者几乎所有种类的微生物细胞都可以用珠磨机破碎, 包括含有包含体的基因工程菌的破壁, 质地坚硬的包含体可以充当研磨剂, 更有利于细胞破

18、壁, 而高压匀浆器则有一定的局限性。6 细胞破碎技术研究的发展方向：6.1多种破碎方法相结合化学法与酶法取决于细胞膜壁的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法或酶法与机械法相结合的原理。6.2与上游过程相结合在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数如、温度、通气量、稀释率等因素对细胞破碎都有影响，因此细胞破碎与上游培养有关。另一方面用基因工程的方法对菌种进行改造也是非常重要的。这方面的工作包括以下几个方面：包含体的形成、克隆噬菌体溶解基因、耐高温产品的基因表达。6.3与下游过程相结合细胞破碎与固一液分离紧密相关

19、，对于可溶性产品来讲，碎片必须除净，否则将造成层析柱和超滤膜的堵塞，缩短设备的寿命。因此必须从后分离过程的整体角度来看待细胞破碎操作，机械破碎操作尤其如此。7 总结：细胞破碎技术的发展极大程度上也推动了细胞胞内产物工业化的生产。在运用细胞破碎方法时，要分析实际需求、结合前人经验，同时也可多种方法结合使用，以求达到性价比最大化。参考文献：1 胡一兵, 胡鸿钧, 李夜光, 等. 从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研究J. 武汉植物学研究, 2002, 20(4): 299-302.2 彭卫民, 商树田, 刘国琴, 等. 钝顶螺旋藻胆蛋白的提取J. 食品科学, 1996(6): 4

20、8-49.3 Keshavarz E, et al. A novel techniqe for measurement of disruption in high-pressure homogenization:Studies on E. coli containing recombinant inclusion bodies, Biotechnol. Bloeng. 1991, 38:3633704 Sauer T, et al. Disruption of native and recombinant E.coli in a high-pressure homogenizer, Biote

21、chnol, Bioeng. 1989,33(10):133013425 Baldwin C, Robinson C W. Disruption of saccaromyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with hig-pressure homogenization,Biotechnol. Techniques. 1990,4(5):3293346 Cooney C L,et al. Release of -galactosidase from E.coli by a plasmid containing a temperature sensieive lytic function, Biotechnol. Lett. 1989,11(12):8458507 苏志国. 高压匀浆破碎法提取酵母胞内蛋白, 生物工程学报, 1990,6（3）：240245