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1、载体的构建载体的构建 Construction of vector 陈玉芹转基因技术的一般实验流程转基因技术的一般实验流程目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定转化载体的构建转化载体的构建E.ColiE.Coli转化，质粒转化，质粒抽提与鉴定抽提与鉴定农杆菌的转化与活化农杆菌的转化与活化外植体制备外植体制备浸浸 染染选择培养选择培养共培养共培养移栽移栽继代繁殖继代繁殖分子检测分子检测生理检测生理检测纯化纯化载体的功能及特性载体的功能及特性载体：携带外源载体：携带外源DNADNA进入宿主细胞的工具。进入宿主细胞的工具。一、载体的功能一、载体的功能1.1.运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因

2、高效转入受体细胞2.2.为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力3.3.为外源基因的扩增或表达提供条件为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体应具备的条件二、载体应具备的条件1.1.具有对受体细胞的可转移性具有对受体细胞的可转移性2.2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.3.长度尽可能小，以提高其载装能力长度尽可能小，以提高其载装能力4.4.具有多种单一的酶切位点具有多种单一的酶切位点5.5.具有合适的选择性标记具有合适的选择性标记 植物基因工程载体植物基因工程载体 克隆载体克隆载体 中间克隆载体中间克隆载体 中

3、间载体中间载体 中间表达载体中间表达载体植物基因工程载体植物基因工程载体 卸甲载体卸甲载体 转化载体转化载体一元转化载体一元转化载体二元转化载体二元转化载体KpnIBamHIhttp:/www.restrictionmapper.org/载体的构建载体的构建KpnIBamHIpKANNIBAL双酶切、连接、转双酶切、连接、转化化E.coil，重组质重组质粒检测粒检测pKANNIBAL:FPSpART27NotI单酶切、连接、单酶切、连接、转化转化E.coil，重组质重组质粒检测粒检测pART：KANNIBAL:FPS质粒的提取质粒的提取原理原理 质粒质粒DNADNA的提取是依据质粒的提取是依据

4、质粒DNADNA分子较染色体小，分子较染色体小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而分离质且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而分离质粒粒DNADNA与大肠杆菌染色体与大肠杆菌染色体DNADNA。方法方法 碱裂解法、溴乙锭碱裂解法、溴乙锭-氯化铯密度剃度离心法、氯化铯密度剃度离心法、DNADNA质粒释放法、羟基磷灰石柱层析法及酸酚法。质粒释放法、羟基磷灰石柱层析法及酸酚法。分离质粒分离质粒DNADNA的方法一般包括三个基本步骤：培的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒化质粒DNADNA。碱裂解法碱裂解法 在pH12

5、.012.5的碱性条件下加热时，连接DNA互补链之间的氢键会断裂，但由于ccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然紧密地结合在一起。与此相反，线性DNA的两条链则完全分开。碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA1 1、培养细菌、培养细菌 将带有将带有pKANNIBALpKANNIBAL的大肠杆菌接种在的大肠杆菌接种在10ml10ml含卡那霉素的含卡那霉素的LBLB培培养液中，养液中，3737摇床培养摇床培养12h12h。2 2、收集和裂解细菌、收集和裂解细菌 （1 1）取）取1.5ml1.5ml菌液置菌液置EppendorfEppendorf小离心管中，小离心管中，4,1

6、2000rpm4,12000rpm离心离心1-2min1-2min，弃上清。，弃上清。（2 2）加入）加入100ul100ul预冷的溶液预冷的溶液I I，充分混匀，吹打。，充分混匀，吹打。溶液溶液I I：50mmol/l50mmol/l葡萄糖葡萄糖 25mmol/lTris-cl(PH=8.0)25mmol/lTris-cl(PH=8.0)10mmol/lEDTA(PH=8.0)10mmol/lEDTA(PH=8.0)注：溶液注：溶液I I需高压蒸气灭菌需高压蒸气灭菌15min15min，贮存于，贮存于44。（3 3）加入）加入200ul200ul新配制的溶液新配制的溶液。加盖后快速颠倒。加盖

7、后快速颠倒5 5次以混合内次以混合内容物，勿振荡。容物，勿振荡。溶液溶液：0.2mol/lNaOH(0.2mol/lNaOH(临用前用临用前用10mol/l10mol/l贮存液现用现稀释）贮存液现用现稀释）1%SDS1%SDS（4 4）加）加150ul150ul冰预冷的溶液冰预冷的溶液，轻轻混匀，冰浴，轻轻混匀，冰浴10min10min。44，12000rpm12000rpm离心离心10min10min，转移上清至另一新离心管中。，转移上清至另一新离心管中。溶液溶液：5mol/l 5mol/l 乙酸钾乙酸钾 60ml60ml 冰乙酸冰乙酸 11.5ml11.5ml 水水 28.5ml28.5m

8、l（5 5）加入等体积的酚：氯仿，充分混匀。）加入等体积的酚：氯仿，充分混匀。44，12000rpm12000rpm离心离心10min10min，吸上清。，吸上清。（6 6）加入）加入0.8-10.8-1倍体积的异丙醇，放入倍体积的异丙醇，放入-20-20，10min10min。44，12000rpm12000rpm离心离心10min10min，弃上清。，弃上清。（7 7）加入）加入70%70%乙醇乙醇300-400ul300-400ul。44，12000rpm12000rpm离心离心5min,5min,弃上清。弃上清。（8 8）吸干，加入）吸干，加入20ul20ul无菌水或无菌水或TETE缓

9、冲液溶解。缓冲液溶解。（9 9）电泳检测。）电泳检测。大肠杆菌感受态细胞的制备、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定 感受态细胞感受态细胞(competent cells):(competent cells):受体细胞经过一些特殊的方法（如Cacl2、Rucl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell)。大肠杆菌大肠杆菌DH5DH5感受态细胞的制备感受态细胞的制备（1 1）从新活化的）从新活化的E.coilE.coil DH5 DH5平板上挑取平板上挑取1

10、 1个单菌落（或感个单菌落（或感受态细胞）接种于受态细胞）接种于10mlLB10mlLB液体培养基中，液体培养基中，3737振荡培养过振荡培养过夜，夜，160170rpm;160170rpm;（2 2）将）将1ml1ml菌液转接到菌液转接到100mlLB100mlLB液体培养基中，液体培养基中，3737振荡扩振荡扩大培养大培养2h2h，使，使ODOD6006000.5;0.5;（3 3）将）将100ml100ml菌液转移到两个菌液转移到两个50ml50ml的离心管中，冰浴的离心管中，冰浴30-30-40min40min，5,000rpm5,000rpm8min8min，弃上清；，弃上清；（4

11、4）用冰冷的）用冰冷的0.1mol/LCacl0.1mol/LCacl2 2以以1/10V1/10V（5ml)5ml)悬浮沉淀，冰悬浮沉淀，冰浴浴20min20min，44，5,000rpm5,000rpm7min7min，回收细胞，在冰浴中用，回收细胞，在冰浴中用1/20V1/20V冰冷的冰冷的0.1mol/LCacl0.1mol/LCacl2 2悬浮细胞（悬浮细胞（2mlCacl2mlCacl2 2+500ul+500ul 75%75%甘油）；甘油）；（5 5）每）每100ul100ul分装感受态细胞，液氮速冻，分装感受态细胞，液氮速冻，-80-80保存。保存。转化（转化（transfor

12、mation)transformation)：是将异源是将异源DNADNA分子引入一细胞株系，使受体细胞分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。究领域的基本实验技术。重组质粒的转化重组质粒的转化转化方法转化方法1 1、化学的方法、化学的方法(热击法热击法)；使用化学试剂（如；使用化学试剂（如CaClCaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNADNA分分子导入受体细胞；子导入受体细胞；2 2、电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受、电转化法：使用低盐缓冲液

13、或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNADNA分子导分子导入受体细胞。入受体细胞。重组质粒的转化重组质粒的转化（热激法）（热激法）1、冰上融化感受态细胞；2、将10ul连接产物加入到100ul感受态细胞，冰浴40min；3、42热激90s，勿摇动！4、热激后立马放置冰上1-2min；5、加400ulLB液体培养基，置摇床，37，70-100rpm 1h；6、涂平板。克隆的筛选与鉴定克隆的筛选与鉴定 不同抗生素基因筛选不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易

14、地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。半乳糖苷酶系统筛选（蓝半乳糖苷酶系统筛选（蓝/白斑筛选）白斑筛选）-互补现象：互补现象：因为许多载体都带有一个半乳糖苷酶半乳糖苷酶（LacZ）基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补）。当这种载体转入可编码半乳糖苷酶C端部分序列

15、的宿主细胞中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。由互补产生的半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。重组质粒转化大肠杆菌过程示意图重组质粒转化大肠杆菌过程示意图重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合-互补现象来筛选。