凯氏定氮法

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1、五&六、总氮量的测定一凯氏定氮法一、目的学习凯氏定氮法的原理和操作技术。二、实验原理蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定 比例关系，其中含碳5055%、氢68%、氧2023%、氮1517%和硫0.32.5%。 此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相 当接近，一般恒定在1517% ,平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每 测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25, 就可以计算出样品中的蛋白质含量。蛋白质总氮量的测定，通

2、常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度 高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生 物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮一一硫酸铵。为加快反应，添加 硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min 至1h或更长时间，视样品的性质而定。消化反应方程式：CH2NH2COOH + 3H2SO4 一 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + N%2NH3 + H2SO4 一 （NH4）2SO4消化完毕后，加入过量浓碱（如NaOH），硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水

3、蒸气将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+ 浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止。(NH4) 2SO4 + NaOH 一 Na2SO4+ 2 NH4OHNH4OH 一 nh3 + h2o +3NH3 + H3BO3 一 3NH4 + + BO33-BO33-+ 3H+ 一 H3BO3最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中总氮量。三、试剂1. 面粉0.1g（对照3、4滴蒸馏水）2. 消化液：过氧化氢：浓硫酸：水的比例为3：2：1,临用时配制（防止腐蚀，小心）。3. 催化剂：硫酸铜（CuSO45H 2O）与硫

4、酸钾（K2SO4）以 1： 3配比研磨混合。4. 30%氢氧化钠溶液5. 2%硼酸溶液6. 标准盐酸溶液（约0.01mol/L）7. 混合指示剂（田氏指示剂）混合指示剂由50mL 0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1%甲 基红乙醇溶液混合配成贮于棕色瓶中配用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色， 变色范围很窄且很灵敏。四、操作方法（一）消化1、编号：取1支清洁干燥的消化管编号，编号后在每瓶内各加1粒玻璃珠。2、加样：在1号管中各加样品0.1g （面粉），加催化剂0.2g,混和消化液5mL。 注意加样品时应直接送入瓶底，而不要黏在瓶口和瓶颈上。在2号瓶中加蒸馆水3-4 滴代替样品，其他试

5、剂同样品瓶，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。3、加热消化：摇匀后，每个瓶口放一漏斗（防止气体冲出），在通风厨内于远红外 消煮炉上消化。开始消化时应以微火加热，不能让液体冲到瓶颈或冲出瓶外，否则将严 重地影响样品测定结果。待瓶内水汽蒸完，H2SO4开始分解放出SO2白烟后，适当加强 火力，使瓶内液体微微沸腾而不致跳荡。继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止（消 化颜色变化：碳化黑色一红色（Cu2SO4,亚铜呈现褐色）一白色烟雾一透明淡绿色）。、原理：2、蒸蒸:实验六凯氏定氮-测定(NH4) 2SO4 + NaOH 一 Na2SO4+ 2 NH4OHNH4OH 一 NH3 + H2O

6、 +NH3+ H3BO3 一 (NH4) H2BO3NH4H2BO3 + HCl 一 NH4Cl + H3BO33、滴定:二、操作：2）定容：消化完毕，待烧瓶中液体完全冷却后，缓慢沿瓶壁加蒸馅水10mL,随 加随摇，分批加入蒸馏水至消化管上刻度（50mL），混匀备用；3）蒸馏：干净的锥形瓶+ 1、2滴田氏指示剂，取10ml消化液一蒸馏瓶田氏指示剂的变色范围窄：pH5.25.45.6紫红暗蓝绿色凯氏定氮仪的设定：a）将NaOH、硼酸、蒸馏水塑料桶拧紧（不漏气）；b）打开冷凝循环水；c）开机，显示“P”，按“转换”钮，设定加酸（1S），加碱（1S）（12ml/S）；d）放好大试管（含10ml消化液

7、），上端密闭；将加入指示剂的三角瓶放在托盘上；e）按启动，仪器开始工作，等三角瓶颜色变绿时，计时12min后，按下托盘，6S后听到“滴滴”声，机器停止工作；f）先取出大试管（湿毛巾取，烫），待收集管无残留液时取出锥形瓶，贴壁，用蒸 馏水冲洗排出口 一滴定。4）滴定全部蒸馏完毕后，用0.01mol/L标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸一指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点，记录所耗HCl溶液量。五、计算C （V1-V2）X14样品中的总氮量（%）=W X 1000、入消化液总量（mL） * %测定时消化液用量（mL）C为标准盐酸溶液摩尔浓度V1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mLV

8、2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mLW为样品重量(g)14为氮的相对原子质量若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，样品中的蛋白质含量()=总氮量x6.25若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。 首先，需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加入三氯乙酸的样 品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量，从而计算出蛋白氮， 再进一步折算出蛋白质含量。蛋白氮=总氮一非蛋白氮蛋白质含量()=蛋白氮x6.25注意事项：必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。思考题1. 测定标准硫酸铵和空白的目的是什么？2. 如何证明蒸馏器洗涤干净？3. 在实验中加入硫酸钾一硫酸铜混合物的作用是什么？