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1、实验三、细菌的革兰氏染色和显微镜油镜的使用,一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和使用方法； 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。,二、实验材料 1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘液、95乙醇、0.5%沙黄染色液 4、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸,三、实验原理,（一）普通光学显微镜（p.21-23） 1.光学部分:接目镜 、 接物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等)。 它使检视物放大,造成物象。 2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器
2、等部件。它起着支持、调节、固定等作用。,图1-1-2 光学显微镜的成像原理,1.放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为： D=0.61/nSin/2 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。,显微镜的放大倍数和分辨率,D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰,（二）油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中
3、间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。,根据公式D=0.61/nSin/2 ，增大分母，使得D值减小，分辨率增大。,1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,（三）显微镜保养和使用中的注意事项,1、实验原理（p
4、.29） 革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。 有芽孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应； 弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。,（四）、革兰氏染色原理及操作,经典法，四步法（p.29-31）,2、实验操作,p.30，采用三区涂片法,大肠杆菌,葡萄球菌,（1）涂片：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚,（2）固定： 染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用加热固定法。固定时尽量维持细胞原有的形态。,注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏
5、细胞形态。,（3）染色（先阅读p.31的注意事项） 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应摔去细胞上的残水，以免染色液被稀释。,（4）镜检(p.24，用低倍、高倍、油镜分别观察细菌) 以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。,（5）显微镜用毕后的处理（p.25） 油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头，但二甲苯量不可过多！,本实验每人做一张。 实验报告中要画图表示结果（低倍、高倍、油镜）。,3、实验报告,实验思考题（回答在实验报告上）,1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样 2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？ 3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？ 4、革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如何控制这一步？,
实验三显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色.ppt
