动物细胞与组织培养.ppt

《动物细胞与组织培养.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物细胞与组织培养.ppt（101页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、,第4章 动物细胞与组织培养,主讲人 王文星 东北大学生物技术研究所,细胞工程教案,本章主要内容 4.1 动物细胞的特点 4.2 动物细胞与组织培养的定义与分类 4.3 发展简史 4.4 动物细胞的体外培养生长特性 4.5 动物细胞、组织培养的基本技术 4.6 干细胞,4.1 动物细胞的特点 动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比进化程度高，结构、成分更复杂，功能更全面。,红血球,巨噬细胞,细胞与细胞,癌细胞,胶质细胞,上皮细胞,4.1 动物细胞的特点 动物细胞与微生物细胞的比较 （1）细胞大，无细胞壁； （2）倍增时间长，生长缓慢，易受污染； （3）需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感； （4

2、）以聚集体形式存在； （5）原代细胞一般繁殖50代左右就退化死亡。 动物细胞与植物细胞比较 共同点：动植物细胞中都有细胞膜、细胞质和细胞核。 区别：动物细胞中无细胞壁、叶绿体和液泡，但是有的植物细胞中无叶绿 体。,4.1 动物细胞的特点 动物细胞连接的5种形式： （1）紧密连接（常见） （2）间隙连接（常见） （3）隔壁连接（无脊椎动物细胞） （4）中间连接（脊椎动物细胞） （5）桥粒连接（常见）,动物细胞有三种类型的细胞连接 封闭连接 紧密连接 锚定连接 桥粒、粘着带 通讯连接 间隙连接、化学突触、胞间连丝,细胞连接（cell junction）： 细胞间的联系结构，是细胞质膜局部区域特化形

3、成的，在结构上包括膜特化部分、质膜下的胞质部分及质膜外细胞间的部分。细胞连接是多细胞有机体中相邻细胞之间通过细胞质膜相互联系, 协同作用的重要基础。,1、封闭连接（occluding junctions) ：, 紧密连接是封闭连接的主要形式。将相邻细胞的质膜密切的连接在一起。 紧密连接的存在部位和结构特点： 又叫不通透连接,它不仅连接相邻的细胞, 而且封闭细胞间隙, 使大多数分子难以在细胞间通透。 这种连接方式普遍存在于腔道上皮细胞靠近管腔端的相邻细胞膜间。 从结构上看, 通过连接蛋白形成焊接线（嵴线），封闭相邻细胞间的空隙。, 紧密连接的功能： 形成渗漏屏障，起重要的封闭作用； 连接作用 隔

4、离作用，使游离端与基底面质膜上的膜蛋白行使 各自不同的膜功能 支持功能,2、锚定连接（Anchor junctions)： 通过细胞骨架系统将细胞与相邻细胞或细胞与基质之间连接起来。 包括桥粒与半桥粒连接和粘合带与粘合斑连接 桥粒与半桥粒连接：与中间纤维相关的锚定连接。 粘合带与粘合斑连接：与肌动蛋白纤维相关的锚定连接。 锚定连接在组织内分布很广泛，在上皮组织,心肌和子宫颈等组织中含量尤为丰富。 主要靠黏着蛋白、整联蛋白和细胞骨架体系将相邻两细胞或细胞与细胞外基质连接在一起。, 锚定连接的类型、结构与功能,与中间纤维相连的锚定连接 桥粒： 铆接相邻细胞，提供细胞内中间纤维的锚定位点，形成整体网

5、络，起支持和抵抗外界压力与张力的作用。 半桥粒：半桥粒与桥粒形态类似,但功能和化学组成不同。它通过细胞质膜上的膜蛋白整合素将上皮细胞固着在基底膜上, 在半桥粒中，中间纤维不是穿过而是终止于半桥粒的致密斑内。 与肌动蛋白纤维相连的锚定连接 粘着带：位于紧密连接下方,相邻细胞间形成一个连续的带状 结构。间隙约1520nm,也称带状桥粒。 粘着斑：细胞通过肌动蛋白纤维与细胞外基质之间的连接方式。, 桥粒连接, 一种特殊的细胞连接，位于特化的具有细胞间通讯作用的细胞。 具有机械的细胞连接作用 通讯连接的方式： 间隙连接 化学突触 胞间连丝,3、通讯连接（communicating junctions)

6、 ：, 间隙连接, 间隙连接处相邻细胞质膜间的间隙为23nm 基本单位是连接子 一种跨膜蛋白 每个连接子由6个相同或相似跨膜蛋白亚单位环绕中央形成孔径为1.5-2nm的水性通道 相邻两细胞分别用各自的连接子相互对接形成分子间的通道，允许分子量在1000道尔顿以下的分子通过。,间隙连接, 胞间连丝, 是相邻植物细胞壁上的一个穿过细胞壁的狭窄通道。 有管状的内质网通过。因此，通过胞间连丝，使得相邻细胞的细胞质膜、细胞质、内质网交融在一起。 胞间连丝直径约30-60nm，允许1000道尔顿以下的分子渗透。, 是存在于可兴奋细胞间的一种连接方式，其作用是通过释放神经递质来传导兴奋。 是神经递质用以传递

7、电信号的通道。将电信号转化为化学信号或将化学信号转化为电信号的过程。 由突触前膜、突触后膜、突触间隙三部分组成。 突触前神经元的突起末梢膨大呈球形，称突触小体。 突触小体内有突触小泡，内含神经递质。, 化学突触,细胞连接的不同方式,各类连接的比较,4.2 动物细胞与组织培养的定义与分类 1、 定义 动物细胞与组织培养（animal cell and tissue culture) 是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 2、 分类 动物细胞与组织培养可分为细胞培养、组织培养和器官培养。,细胞培养(c

8、ell culture):细胞培养是指细胞的体外培养,这是在无菌条件下,将机体内的组织取出,分散(机械或酶消化)成单个细胞,在模拟体内的环境中,给以营养物质,使细胞不断生长、繁殖或传代,借以观察细胞的生长、分裂、接触抑制以及衰老、死亡等生命现象。细胞培养也包括单个细胞的培养。,器官培养(organ culture):器官培养是指器官的原基(芽胚基)、整个器官或器官的一部分,在体外条件下保存(维持)或生长,并能分化和保持结构和/或功能。,组织培养(tissue culture):组织培养是指组织在体外条件下的维持或生长。此种方法可有组织分化及保特组织的结构和/或功能的特点。这里需要说明的是,当我

9、们做组织培养时,不论用什么方法和条件,组织培养中的主要成分仍然是细胞;细胞在生长过程中总有移动(运动)和其他变化,这样就使得被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长,发生变动的可能性越大。结果常使单一类型的细胞易保存下来,最终也成了细胞培养。 所谓细胞培养,并不意味着细胞彼此之间是独立的。细胞在培养中的生命活动和体内细胞一样,仍然是相互依存的,呈现一定组织的特征。所以组织培养和细胞培养并无严格区别,两者在一定程度上可看作是同义语。,细胞体外培养可分为原代培养与传代培养 原代培养(primary culture):是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增

10、殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。 传代培养(subculture)：从原代培养的细胞继续转接培养的过程。 细胞系（cell line）：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记的单一类型的细胞群体。 体外动物细胞在形态结构上均程度不同的与原来的细胞有所差异。,4.3 发展简史,第1次成功地培养脊椎动物细胞是在1907年,美国科学家Harrison首先利用蛙淋巴液来培养蛙胚神经管,并观察到神经纤维是由细胞质进行阿米巴运动所形成,解决了当时争论不休的神经纤维起源

11、问题。是动物细胞组织培养的奠基人。 1912年德国科学家Carrel采用更换培养基和传代的方法解决了组织块长期存活的问题；设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1943年,Earle首先培养C3H小鼠的结缔组织并用致癌物20-甲基胆蒽处理,获得了能回种于小鼠体内并生长肉瘤的长期培养的细胞系,定名为L细胞系。 5年之后,Sanfold使用预先处理的条件培养基(condition medium)成功地使L细胞系的一个单细胞在体外发展成“克隆”(clone)并繁殖成克隆株。 1951年Gey成功地用人的宫颈癌组织建立起能在体外连续培养的人的肿瘤细胞并定名为HeLa细胞系。这些细胞至今仍在世界各国

12、广为应用。L与HeLa细胞系就成为最早建成的动物与人的细胞系。,1955年Eagle研制成人工合成的培养基,使组织培养工作的劳动量大大减轻。 20世纪70年代Sato等人发展了无血清培养,解决了血清中存在的一系列问题,使细胞培养技术得到长足的发展,并推动了基因工程产品及其产业的发展。 20世纪70年代以来,我国组织培养技术发展更快,它已不再是个别研究室所拥有的技术,而是已成为生物学和医学研究中普遍应用的手段。近20年建立的各种细胞系已不可胜数。最近我国科学家对干细胞的研究已走在世界前列,特别是治疗性克隆研究已达到世界先进水平。,4.4 动物细胞的生长特性,1、在活体内的生长特性 ，动物细胞:

13、分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有明显的形态学特征。 例如： 肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能； 神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。,增殖 分化,活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类： 第一类是能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞； 第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞； 第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细

14、胞分裂。如人的肝脏细胞等。 第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。,2、动物细胞的体外培养生长特性,离体培养的动物细胞可分为： （1）贴附依赖型(anchorage-dependent) （2）非贴附依赖型(anchorage-independent) （3）兼性贴附细胞,（1） 贴附型细胞,简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。,贴附型细胞： 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞。 贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。 结果: 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能

15、生存和生长。 体外培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞 贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有贴附于固相表面才能生存的细胞。,细胞在体内、外的贴附方式：存在差异。 体内：贴附是全方位,外形具有复杂的立体特征。 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同。 贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料 按照培养细胞的主要形态，可分为以下几大类型： 成纤维细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的。 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞

16、， 血管内皮。 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则 三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起， 中有卵圆形核。 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独 的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。,成纤维细胞型细胞,成纤维细胞型细胞,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同。 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤。 形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。,上皮型细胞,上皮型细胞

17、,游走型细胞 特点：分散生长，细胞胞质常伸出伪足和突起，生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。 此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大连成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。,巨噬细胞,多形型细胞 特点：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。如神经元和神经胶质细胞。,（2）非贴附型细胞（也叫悬浮型细胞） 特点：细胞体外生长不贴壁，可在培养液中悬浮生长，胞体始终为球形。如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些

18、肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。 这类细胞一般呈圆形，密度较大，培养效率高，可进行悬浮培养，易于大规模生产，便于过程的控制。,（3）兼性贴壁细胞 动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。,3、影响细胞形态学特征的主要因素： 血清成分、培养基的酸碱度、气相环境、培养基成分及添加成分、温度等。如Hela细胞原本是上皮型癌细胞，但若在过酸或过碱的条件下培养，可呈梭形，当酸碱度适中时又可恢复上皮型特征。 因此，细胞形态学仅是对培养物判断或识别的一种参考价值指标。若想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异性的鉴定方法。,4.5

19、 动物细胞、组织培养的基本技术,1、培养细胞的生长特点 2、培养细胞的生长过程 3、动物细胞培养的基本条件 4、动物细胞培养的传统方法 5、原代培养技术 6、传代培养技术 7、贴壁技术 8、细胞系与克隆株 9、细胞的常规检查 10、细胞保存技术,1、培养细胞的生长特点,细胞在体外培养生长时其基本生物学规律与在体内时相同。但由于生活环境条件的改变，有些方面如增殖的规律等，与体内不完全相同，而有其自身的规律。 体外培养细胞重要的生长特点有：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制。,接触抑制(contact inhibition)现象： 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的

20、基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。,有限细胞系和永久细胞系 动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养（primary culture）。 经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，一般经过3050世代后细胞将逐渐死亡。,“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50

21、代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。,大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。 永久细胞系有如下特征： 细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌

22、率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前提。,2、 培养细胞的生长过程 单个细胞生长过程：细胞周期 动物细胞分裂周期一般为1248小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。 细胞系的生长过程,3、动物细胞培养的基本条件,在体外培养细胞必须要能够维持和模拟细胞在体内生存的良好环境和物质代谢过程。为此必须提供必要的营养、严格的无菌条件、适宜的pH、渗透压、培养器皿、温度和CO2等条件。显著污染的标志是培养基pH迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现飘浮的集落。,（1）动物细胞培养的环境

23、要求,1）无污染环境 2）温度 温度是细胞体外生存的基本条件之一，来源不同的细胞，其最适生长温度不尽相同。 如昆虫细胞培养温度一般是2528 哺乳动物细胞的培养温度一般是37。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳动物细胞在45下只能存活1小时，但在25条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。,3）pH 动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。 培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐

24、性。,4）气体环境及溶氧 一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。,5）渗透压 动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题： 一是培养基的渗透压维持； 二细胞体内的渗透压维持。 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。,（2）动物细胞培养的营养要求,1）天然培养基 直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分

25、作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。 血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。 使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。 血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。,2）合成培养基 目前用于动物细胞培养的合成培养基种类很多，一般均包含氨基酸、维生素、糖类、无机离子和其它辅助成分（激素、生长因子）。 尽管各种合成培养基给细胞培养带来极大方便，但许多实验表明，单纯使用合成培养

26、基细胞的贴壁、增殖效果常常不理想。因此，在使用时通常仍然需要加入一定量的动物血清，常用的动物血清有小牛血清、鸡血清等。 常用的人工培养基MEM，DMEM，RPMI-1640,3）无血清培养基,动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。 无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。,1、平衡盐溶液（BSS） 2、消化液：胰蛋白酶液、Na2- EDTA液、胶原蛋白酶液 3、pH调整液：NaHCO3溶液、10%醋酸溶

27、液、HEPEs液 4、抗菌素液：青霉素、链霉素（双抗）液、卡那霉素液、制霉菌素液 5、肝素抗凝剂 6、200 mmol/L 谷氨酰胺,4) 细胞培养溶液,（3） 培养工具 根据不同性质的培养可采用不同的培养器皿:固体单层培养可生长在塑料或玻璃瓶壁上,半固体培养可采用胶原或琼脂等凝胶培养,悬浮培养则可用培养基直接培养。我们现在通常使用优质中性玻璃制成的长方形玻璃培养瓶,规格有100mL、25mL和15mL等。有时还用扁圆形的卡氏瓶。它们的优点是可以清洗、消毒、反复使用。细胞培养所用的器皿必须干净,器械的清洗是十分重要的,它直接影响到细胞培养的成败。,（1）悬滴培养法 （2）旋转管培养法 （3）灌

28、注小室培养法 （4）卡氏瓶培养法 （5）培养板培养法,4、 动物细胞培养的传统方法,（1）悬滴培养法(drop culture)最简单、最原始的培养法 悬滴培养法缺点：细胞生长空间狭小气体不足，不能持续长时间生长培养基易液化，需要常更新培养基凹玻片折光，不便于观察。,（2）旋转管培养法(rotate tube culture) 组织块或细胞可交替地接触营养液和空气，利于细胞生长； 培养管缓慢转动，使整个管内壁全部长满细胞，提高了细胞产 量，适于较大量的组织培养和各种长期传代细胞组织块或细胞可交替的培养。 缺点：不易在显微镜下观察。 （3）灌注小室培养法(dabble booth cultiva

29、tion) 为大规模培养系统提供了参考原理。,（4）卡氏瓶培养法 卡氏瓶(carlsbergs flask)（如下图）： 将组织块剪碎，BSS漂洗。 转移到另一只培养皿，在解剖显微镜下去掉不需要的组织如脂肪、坏死组织等。将组织块切成1mm3小块。 用预先润湿的滴管转移到消毒离心管，静置使组织小块下沉，吸去上清。以新鲜BSS漂洗。重复23次。,转移到培养瓶（每个25ml的培养瓶可放置2030块组织小块），吸去液体。加入1ml生长培养液，轻斜摆动培养皿，使组织小块均匀分布。盖好瓶盖，36.5培养1824h。 待组织块粘附瓶壁后35天，加入5ml培养液；然后每周更新培养液一次。培养35周，细胞不断增

30、长，肉眼或低倍镜下观察可见围绕组织周围生长犹如日晕，称“生长晕”。 取出中央组织块，用预先湿润的滴管移到另一新的培养瓶。重复操作。 在原生长晕培养瓶内换入新鲜培养液。待生长晕细胞扩展至约50%培养瓶底表面时，进行细胞培养。,5、原代培养技术 一般经过组织获得、组织消化、接种、培养、传代等过程。,动物细胞培养的基本步骤包括：先对动物体的器官组织进行切割、酶解消化，分离出单个细胞，再将单个细胞转入含有葡萄糖、氨基酸和无机盐的动物细胞培养细胞培养液中，在二氧化碳培养箱中温育培养，在将原代细胞传代，扩大进行继代培养。,（1）组织块培养,步骤如下： 1、培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做

31、好洗手等准备工作. 2、点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等 。 3、取材：,（2） 组织消化培养,6、传代培养技术(观看教学影片),传代的理想时期：对数生长期，细胞8090%或刚刚全部汇合。 方法： 消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶与EDTA混合液，盖满瓶底，作用25min； 检查：如细胞间隙变大，细胞质回缩，则终止消化。 终止消化：吸出消化液；加入Hanks液，轻轻转动，洗去残留的消化液。如单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。 细胞计数：用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落，制成悬液，计数并记录其浓度； 重新稀释接种培养。,根据细胞特点，掌握细胞消化时间和选择消化方法。,7、贴壁技术 贴壁培养的材料与

32、系统 （1）主要材料： 玻璃 塑料 金属 微载体 （2）系统： 微载体培养系统 多孔载体培养系统 中空纤维培养系统,微载体培养法(microcarrier culture) 载体：DEAE-交联葡聚糖微粒、DEAE-纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、无机玻璃基质微载体等。 微载体培养系统培养细胞步骤： 1、选择合适的微载体类型获得最大量的细胞，以微载体能全部悬浮在培养液内为最好。 2、浸泡水化及消毒 用无Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲液浸泡3h以上。 3、接种（根据细胞类型决定接种浓度） 4、培养观察与细胞计数 5、消化 6、分离细胞或传代培养,多孔载体培养(porosity carrier c

33、ulture) 优点：增加细胞固定化稳定性，比表面积大，保证细胞充分的生 长空间，细胞生长在载体内部，免受机械损伤。 多孔载体被证明是用于大规模高密度细胞培养的优秀细胞生长 支持物，具有逐步取代传统的实心微载体的趋势。 中空纤维细胞培养法 (hollow fiber cell culture) 模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管” 中空纤维来供给细胞生长的营养等条件。 细胞向三维空间生长繁殖，形成类似组织的多层细胞群体，细胞 密度可达109个/ml 。 适用于细胞代谢产物和分泌物的生产。,8、细胞系与细胞株（cell line and clone） （1）细胞系的建立 原代培养

34、的培养物中所含的细胞类型多而复杂，培养初期，生长的 细胞类型多种多样随培养时间延长：一些细胞退化、死亡；另一些 细胞适应环境而生长繁殖培养物逐步变均匀。 传代培养意义：不仅在于维持细胞不断地生长，而且使培养物逐 步演变为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞 系。 细胞系：指从原代培养物经传代培养后得来的一群特征专一、类 型均匀的细胞，可以长期连续传代。 限定细胞系（有限细胞系）：寿命有限，一般为2080代。 连续培养细胞系（无限细胞系）：细胞发生转化，可连续培养和生长，寿命变为“无限”。,（2）细胞株（克隆株） 分离单一细胞并使其繁殖形成的细胞群称为细胞株。 单个细胞的生活能力很

35、弱，必须采取特殊的培养措施。 适应和同化过程：在细胞接种到新培养液的初期，细胞既从培养液 中摄取营养，也要向培养液排出一定物质，其结果使得培养液更易被吸收和利用。 适应培养液: 制备：选择生长状态良好的对数生长期细胞，无死细胞和碎片，所用细胞的种类应与要克隆的细胞相同。吸出培养液，用G6滤器过滤贮于冰箱中备用。 制备适应性培养基时注意：选用成分齐全的合成培养基，可不加抗生素。,细胞株的制备方法（3种）： （1）集落形成分离法 平皿中接种稀释细胞细胞贴壁繁殖成许多小群选择一个最好的细胞群做标记机械法刮除所有其他细胞群培养保留下来的细胞群.,克隆成功的关键： 接种细胞数量要合适、细胞要分散得好。

36、太多则使细胞操作不便，以每个平皿50100个细胞为宜。 选择细胞克隆时，应逐日观察，能证明被选留的细胞群确系来自于单个细胞。刮除和洗涤一定要彻底。,（2）琼脂分离法（agar Separation） 琼脂培养基的制备： 选择质量好的琼脂，用三蒸水配成3%的溶液，分装，灭菌。 培养方法： 向琼脂平皿中接种稀释细胞悬液（适应培养基），培养后，标记出保留细胞，在显微镜下切下保留细胞处琼脂小块，在BSS中轻轻漂洗后，用适应培养基继续培养。,（3）多孔塑料板分离法（foamed plastics Separation） 将1ml含有78个细胞的悬液接种到多孔无毒塑料板中，每一块板上有数十个圆形。选择仅有

37、单个细胞的小孔观察，待单细胞繁殖成克隆充满小孔后，用胰酶消化分离细胞，转移至培养瓶中继续培养。,9、细胞的常规检查（corpuscular routine examination） 检查内容：细胞的生长状态、培养液pH 、污染、细胞活力。 细胞生长 潜伏期：不同组织和细胞潜伏期不同。 胚胎组织次日可见生长，1周内即连接成片。 老年组织、癌组织潜伏期长。 游离期 细胞呈悬浮状态。细胞质回缩，胞体呈圆形。 吸附期：与细胞种类、培养环境有关。 大多数在24h内贴壁。细胞机能状态不良或濒死细胞不贴壁。 培养基偏酸或偏碱、污染、胶基有毒、培养瓶洗刷不洁等均不利于细胞贴壁。 支持物表面带正电荷利于贴壁。,

38、繁殖期（idiophase） 细胞由圆形变成延展细胞，进而过渡成极性细胞；继之出现细胞分裂，细胞数目不断增多；同时有一定的移动现象。 退化期（catagen） 细胞长满瓶壁后，如不及时做再培养，由于营养物消耗和代谢物积累，细胞变得粗糙（轮廓分明、胞内颗粒状物堆积），严重时甚至从瓶壁脱落。,细胞形态（cellular shape） 生长良好细胞：倒置显微镜下观察透明度大，轮廓不清。 机能不良细胞：轮廓鲜明，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物；细胞形态不规则，失去原有特点；细胞间隙加大。 培养液pH 正常情况下，培养液呈桃红色。 随细胞生长时间延长，CO2积累增多，超出缓冲范围后酸化变黄，须及时

39、更换。,微生物污染(microbial contamination) 常见来源：培养液、培养塞、血清、操作时空气污染。 常见病菌：霉菌、细菌、支原体。 霉菌：培养基中出现相应的菌落。 细菌：培养液混浊，镜下可见大量细菌；如怀疑污染而培养液无 明显改变时，可将培养物进行细菌培养以验证。 支原体污染：经常发生而难以发现。污染后的细胞仍能生存，甚 至无明显变化；有时可发生不同程度的病理改变。 预防方法：严格遵守无菌操作。并针对不同污染采取相应措施。,细胞活性(cytoactive) 原理：细胞对色素的吸附性 方法：常用的是染色排除法，即死细胞着色法 台盼蓝染色：0.4g台盼蓝，溶于100ml Han

40、ks液，调pH至7.07.2。按细胞悬液：染液=9：1比例混合，4min后计数。注意时间过长，活细胞亦可受损而着色。 苯胺黑染色：0.05%苯胺黑（溶于Hanks液）同上比例染色，稍放置后镜检。注意苯胺黑溶解性较差，用前应先过滤。 藻红B染色：0.02%藻红B（溶于Hanks液）染色，2h内镜检。注意藻红B易同蛋白质结合，须把血清洗净。 另：活细胞着色法 ：结晶紫染色：0.1%结晶紫（溶于Hanks液）染色，混合后立即镜检。,10、细胞保存技术 （1）细胞的冻存 细胞系和细胞株的保存：超低温冰箱、液氮罐 冷冻保护剂的作用：结合细胞中水分子，降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以免对细胞造成伤害。

41、常用冷冻保护剂：DMSO、甘油。 （2）细胞的复苏：慢冻快融，迅速投入37水浴中。,4.6 干细胞,4.6.1 定义 干细胞（Stem Cell)是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的未分化细胞群体，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织器官。,干细胞发展史,1878：出现第一篇哺乳类的体外受精卵报导。 1959：完成第一例兔子的体外受精卵。 1960：展开畸胚瘤的研究。 1968：爱得华（R.G. Edwards）和贝敏思特（B.D. Bavister）进行人类的体外受精研究。,从1970年Martin Eva

42、ns首次从小鼠胚囊中分离出小鼠胚胎干细胞，到原被误认为功能单一的干细胞后被证实具有自我复制能力，且可分化为人体206种组织器官的原始细胞。 1978：世界第一个试管宝宝路易丝布朗（Louise Brown）在英国诞生。 1980：肯蒂丝瑞得（Candace Reed）成为澳洲的第一个试管宝宝。 1981：艾凡斯等（M.J. Evans, et al.）体外培养老鼠的胚胎干细胞；伊莉莎白卡尔（Elizabeth Carr）成为美国的第一个试管宝宝。 19841988：安德鲁等（P.W. Andrews, et al.）在体外培养人类畸胚瘤细胞。 1989：佩拉等（M.F. Pera, et al

43、.）制造人类畸胚瘤细胞株。 1994：首次使用人类人工受精的囊胚进行干细胞的研究。 19951996：从恒河猴取得胚胎干细胞，并在体外培养分化成三种胚层。,1998：詹姆士汤姆生（James Thomson）从人类体外受精卵取得胚胎干细胞，并能稳定地在体外培养；吉尔哈特（J. Gearhart） 从妊娠中止的胎儿内取出其卵巢或睪丸组织，得到一种具有干细胞特性的原始生殖细胞，称为人类生殖干细胞。 1999：科学（Science）杂志公布干细胞为世界十大科技进展榜首。从小鼠肌肉组织取得的成体干细胞可以横向分化为血液细胞。此后，科学家相继证实成体干细胞具有可塑性。 2000：美国61名诺贝尔奖得主及

44、其它科学家联名要求美国政府对干细胞研究给予全面支持，同年美国总统柯林顿宣布美国政府准许用政府经费进行人体胚胎干细胞研究。 2001：胚胎干细胞株可以培养出神经、胰岛等更多种类的细胞。美国总统布什宣布联邦政府将有限资助胚胎干细胞研究。 2002：自然（Nature）杂志评选干细胞的争议为2002年科学界年度重大新闻。,4.6.2 干细胞的特性,4.6.2.1 形态和生化特征 1、干细胞形态上通常呈圆形或椭圆形、体积小、核质比例较大。 2、干细胞具有较高的端粒酶活性，因此具有较强的增殖能力。 4.6.2.2 干细胞增殖特性 1、缓慢性：有利于干细胞对特定的外界信号做出反应，以决定进行增殖还是进入特

45、定分化程序。另外，还可以减少基因发生突变的可能性，使干细胞有足够时间发现和纠正复制错误，从而避免产生自身突变。 2、自稳性：即干细胞会自我更新维持自身数目的恒定。这是干细胞区别于肿瘤细胞的一个本质特征。,干细胞的形态,胚胎干细胞克隆,4.6.2.3 干细胞巢及其微环境,干细胞在机体内的居所称为干细胞巢。在干细胞巢中所有控制干细胞增殖与分化的外部信号构成了干细胞生存的微环境。如：分泌因子、受体介导的细胞间的相互作用、整和素和胞间基质等。,正常胚胎发育过程是按严格的时空程序进行一系列细胞与细胞之间、核质之间相互作用的结果。 从全能配套干细胞或组织谱系干细胞最终分化为体细胞，主要取决于哪些基因被激活

46、和在什么时间与位点被激活。细胞环境中的各种因子的类型和浓度则是基因选择性激活的重要因素。 细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异表达、从而控制专一性蛋白的合成和排布的结果。 对细胞分化来说，最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合，并受不同层次的基因调控网络系统精确无误的条件和控制。这一彼此协调而又相互制约的复杂过程通常称为发育的遗传程序。,4.6.2.4 干细胞的发育,4.6.3 干细胞的分类,根据干细胞来源的种属可分为人干细胞、小鼠干细胞、牛干细胞、猪干细胞等。 根据干细胞所具有的分化功能可分为单能干细胞、多能干细胞与全能干细胞。 根据干细胞的来源可分为成体干细胞（Ad

47、ult stem cell）和胚胎干细胞（Embryo stem cell , ES细胞) 。,最近几年的研究表明，多能干细胞的分化能力远超过传统观点局限的范围。例如骨髓成体干细胞在合适的体内外环境中可长期生长，也可分化为成骨细胞 、软骨细胞、脂肪细胞 、平滑肌细胞 、成纤维细胞、骨髓基质细胞及多种血管内皮细胞。还可形成一种肝脏前体细胞肝卵园细胞，神经、胶质细胞和心肌细胞,4.6.4 胚胎干细胞,胚胎干细胞来自于哺乳动物，包括人类早期胚胎的胚囊内细胞群。它能长期维持未分化状态，又有全能分化的潜能和无限增殖的能力，在体外培养时仍能维持正常和稳定的染色体组型。在特定的环境诱导下，胚胎于细胞能分化成

48、内、中、外三个胚层的各类细胞系，如上皮细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、神经元、造血细胞等。如将胚胎干细胞放入受体胚囊中，它可以参与整个生物体的发育。,胚胎干细胞,胚胎干细胞培养过程,人胚胎干细胞的分离及体外培养的成功，将给人类带来医学革命。 体外研究人胚胎的发生发育 非正常发育（通过改变细胞系的靶基因） 新人类基因的发现 药物筛选和致畸实验 作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源,胚胎干细胞研究的意义,成体干细胞是存在于成体动物的许多组织和器官，具有修复和再生的能力的细胞。 成体干细胞大多数时候处于静息状态。 在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从

49、而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,4.6.5 成体干细胞,神经干细胞,造血干细胞,间充质干细胞,4.6.6 胚胎干细胞较成体干细胞的优势: 1、胚胎干细胞能永生化，可以传代建系，且增殖能力强，来源充沛。 2、虽然成体干细胞具有向多系分化的能力，但这种分化的“效率”尚不理想。 3、胚胎干细胞具有全能性。,4.6.7 与胚胎干细胞相比，成体干细胞也具有一些优势： 1、 胚胎干细胞具有全能性和可以建系传代等优点，因此理论上应用前景广阔。但实际上由于每个个体的主要组织相容性复合体（MHC）不同，同种异体胚胎干细胞及其分化组织细胞用于临床会引起免疫排斥，因此基于胚胎干细胞的治疗方案要求对患者进行

50、长期免疫抑制剂治疗或将患者的造血系统和外来细胞形成嵌合体。 成体干细胞则可从患者自身获得，而不存在组织相容性的问题，治疗时可避免长期应用免疫抑制剂对患者的伤害。此外，少量的骨髓切除治疗有助于形成部分造血嵌合，可使异体成体干细胞的治疗成为可能。,2、 虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是“非定位性”的。目前尚不能控制胚胎干细胞在特定的部位分化成相应的细胞，当前的做法容易导致畸胎瘤。相对而言，成体干细胞不存在上述问题，例如骨髓移植实验并不引发畸胎瘤。3、 成体干细胞也具有类胚胎干细胞的高度分化能力。从肌肉、肝脏、骨髓中成功地发现和分离了成体干细胞群，完成了干细胞定向诱导分化成骨、软骨、

51、神经细胞、心肌细胞和血管内皮细胞的研究；最近又研究发现，从胰腺等组织可分离出间充质表型的成体干细胞群，具有多系分化潜能。,总之，成体干细胞和胚胎干细胞各有自身的优势和缺陷。对于一个实验室而言，同时开展对两者的研究，不仅是可能的，而且能互为裨益，相得益彰。两者的研究对干细胞领域而言都是必要的。,美国哈佛大学的科学家做了一个有趣的实验，研究者们首先教会两只鹦鹉唱歌，然后把其中一只鹦鹉的脑中枢神经破坏，这只鹦鹉就失去了唱歌本领。然后，再从另一只鹦鹉身上提取干细胞注人这只受损的鹦鹉体内。不久，奇迹出现了，那只不会唱歌的鹦鹉又恢复会唱歌的本领。原来，干细胞在进入异体后，可以根据受体的信息修复，整合出受体中受损细胞的原始功能。,美国科学家们发现，未发育完全的骨髓干细胞可以自行转移到人脑，并可以转变为功能齐全的脑细胞。科学家们相信，这个发现可能最终将有助于发现治疗脑损伤、老年痴呆症以及帕金森氏综合症的新疗法。,全球第一起医治严重地中海贫血症的非亲属脐带血干细胞移植手术，在新加坡成功进行，受惠者是一名5岁半的华裔男童胡智善。,思考题,重点将教材第4章后的课后题进行思考练习。,