功能基因组学

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1、功能基因组学功能基因组学20世纪人类科技史上的三大创举40年代第一颗原子弹爆炸60年代人类首次登上月球90年代人类基因组计划基因组(genome)泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。一、基因组学概念及范畴基因组学(genomics)是指发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部基因组结构及功能。基因组学包括3个不同的亚领域结构基因组学(structural genomics)功能基因组学(functional genomics)比较基因组学(comparative genomics)基因组学概念结构基因

2、组学结构基因组学(structural genomics)是通过人类基因组计划HGP的实施来完成的。HGP的内容就是制作高分辨率的人类遗传图和物理图，最终完成人类和其它重要模式生物全部基因组DNA序列测定，因此HGP属于结构基因组学范畴。人类基因组计划（HGP）的研究内容遗传图的分析（Genetic map）确定基因或DNA标记在染色体上的相对位置与遗传距离 物理图的分析（Physical map）以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点）为路标，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。将各种标记直接定位在基因库中的某个位点上。转录图的分析（Transcriptional map）分离纯

3、化mRNA或cDNA比较分析蛋白质的编码能力，使人们有可能系统、全面地从mRNA水平了解特定细胞、组织或器官的基因表达模式，并解释其生理属性，深入认识细胞生长、发育、分化、衰老和疾病发生的机制。序列图分析（sequence map）测定由30亿个核苷酸组成的全部序列。人类基因组的核苷酸序列图其实是分子水平上最高层次，最详尽的物理图。二、后基因组学的研究（Postgenome era）人类基因组计划完成之后，生物学被重新划分为前基因组和后基因组两部分。科学研究已开始进入“后基因组时代”。主要是开展功能基因组学和蛋白质组学的研究。有科学家形象地说道：即使基因测序全部完成，也只好像是一本没有姓名，只

4、有号码的电话簿。“后基因组时代”的最终目标，是要把深奥的DNA语言变成一本大基因百科全书。功能基因组学功能基因组学，后基因组学(Post genomics)：利用结构基因组学提供的信息和产物通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。功能基因组学的目的基因功能发现基因表达分析及突变检测从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。1、功能基因组学的研究内容基因功能的研究基因组的表达及时空调控的研究蛋白质组及蛋白质组学的研究基因组多样性的研究模式生物体的基因组研究2、功能基因组学的研究方法单核苷酸多态性（SNPs）分析表达

5、序列标签（ESTs）分析基因表达的序列分析（SAGE）DNA芯片RNA干扰蛋白质组学（双向电泳质谱）单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP)定义 单核苷酸多态性是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置发生了转换，颠换，缺失和插入等变化而引起的序列多态性，而且任何一等位基因在群体中的频率不小于1%。SNPs在GC序列上出现最为频繁，以C-T最多见。据估计SNPs在人类基因组的平均密度为1/1000，数量巨大，因此多态性信息含量高。中英联合实验室DNA（分子）标记限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（restriction fragment lengt

6、h restriction fragment length polymorphisms,RFLPpolymorphisms,RFLP）简单序列长度多态性简单序列长度多态性（simple sequenece length polymorphisrns,SSLPs)simple sequenece length polymorphisrns,SSLPs)小卫星序列：（小卫星序列：（Minisatellite DNAMinisatellite DNA）微卫星序列：（微卫星序列：（Microsatellite DNA,MSMicrosatellite DNA,MS）单核苷酸多态性标记单核苷酸多态性标记

7、（single nucleotide polymorphisms,SNPsingle nucleotide polymorphisms,SNP）SNPs与表型编码区内的SNPs可能改变氨基酸残基的种类，这可以直接影响蛋白质的功能；外显子和内含子相连部位的SNPs可能改变外显子一内含子的剪接，影响蛋白质的修饰；在调控区域内的SNPs可以改变mRNA的表达水平和稳定性。以SNPs为基础研究人类疾病遗传学家寻找致病基因的基本策略是：连锁分析和关联分析。连锁分析是确定两个遗传标记或者更多遗传标记之间的物理关系，以确定致病基因的位置。关联分析是研究某种遗传标记与某一特定表型的之间的关系表达序列标签（Ex

8、pressed sequence tags,EST）ESTs是从已建好的cDNA文库中随机取出一个克隆，从5末端或3末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。EST的应用构建遗传学图谱 遗传图谱、物理图谱和转录图谱,是基因组计划要获得的3张遗传学图谱。构建染色体物理图谱需要大量的单拷贝短序列作为界标,由于大多数基因是单拷贝的,所以可以用EST序列充当序列标签位点(STS)。而且,由于EST序列是转录基因的产物,可用来直接构建遗传连锁图,通过与基因组文库序列比较,可以提供内含子结构,可选择剪切方式,转录起始和终止位点等信息。EST的应用分离和鉴定

9、新基因 将所获得EST用生物信息学方法与公共数据库中的已知序列比对,可以迅速准确的确定基因的功能。由于在构建cDNA文库时要尽可能的选用全长cDNA,所以一旦发现有价值的EST,可以找到对应的克隆,获得的全长cDNA可以直接用于转基因等研究。利用EST方法进行发现、分离基因的研究,不仅是人类基因组研究的热点,而且也是模式生物基因研究的重要内容。EST的应用基因差异表达的研究 通过比较不同发育时期和每个发育时期不同组织器官cDNA文库中的EST信息,可以绘出该物种在特定时间和空间的基因表达的发育顺序谱。因为一个基因表达的峰度越高,它被随机调出而被测序的次数越多,而比较众多cDNA文库的EST数据

10、可以推测1个基因在不同组织或器官中表达的差异。EST的应用基因的定位克隆 以EST为重要来源的染色体物理图谱进一步方便了对抗病基因的连续分析,可将抗病基因定位在染色体中的狭小区段,缩小抗病基因的筛选范围。同时,EST标记是功能序列区的标记,处于目标基因的范围内,是目标基因的编码区,因此EST标记是分离功能基因的有效标签,大大提高了克隆基因的效率。EST的应用比较基因组学的研究 利用EST序列中古老保守序列来研究生物中间的进化关系,可以避免选择家系、构建群体、大量的统计分析等周期,长而繁琐的遗传图谱的制作过程。此外,利用基因组较小的模式生物所获得的已知功能基因,用复杂基因组生物,如人和动植物的E

11、ST比较,从而推测,待测EST的功能,已经成为比较基因组学研究的重要内容。EST的应用用于制备cDNA芯片 芯片技术,是目前高通量筛选EST的有效方法。随着更多基因组计划的开展和更多已知功能基因的积累,将来无需进行测序,只通过DNA芯片技术就可以研究基因的功能。EST计划的实施不仅获得了关于表达基因的信息资源同时也获得了大量已经经过功能鉴定了的cDNA克隆资源而这些资源都是功能基因组研究所不可缺少的。SAGE（serials analysis of gene expression）基因表达系列分析 1995年，JohsHopkins大学的分子肿瘤学家Kinzler和Vogelstein及其同事

12、建立了SAGE方法.SAGE SAGE 技术的主要理论依据：技术的主要理论依据：来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（911bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可作为区别转录物的标签（tag）；通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大量多联体（concatemer），对每个克隆到载体的多联体进行测序，并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定基因的表达丰度（abundance）。1.将5g含有oligo dT（引物）的磁珠与RNA混合。2.合成双链cDNA。3.用Nla酶消化形成一条链末端有标签的产物。4.将样品分成两份，连接成含有识别序列的产物，以备

13、用BsmF1消化。5.用Mme I切割每一个样品形成约60bp的标签。SAGE 步骤步骤6.延伸5秒，连接成约130bp的双链标签。7.PCR扩增。8.用Nla 酶切130bp产物释放34bp双链标签。9.连接片断形成串联体。10.克隆到pZErO-1+里，并测序。SAGE实例实例DNA芯片DNA芯片（DNA chip）也叫基因芯片（Gene chip）是指在固相载体（玻璃，硅等）上有序地，高密度地（点间距小于500m）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸（也叫探针）。这些被固定的分子探针在基质上形成高密度的DNA微阵列，因此DNA芯片又叫DNA微矩阵（DNA Microarray）DNA芯片的基

14、本原理基因芯片技术是建立在Southern blot基础之上的，可以说它是Southern blot的改进和发展，它的原理是：变性DNA加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。基因芯片基本操作流程制备总RNA mRNA经RT-PCR用Cy3（正常对照组）和Cy5（实验组）荧光标记目的基因，得到cDNA探针 混合标记探针 与表达谱芯片上核苷酸片段（或基因）杂交 扫描 分析杂交结果 结论基因芯片基因芯片基因芯片的应用基因芯片的应用生物信息学的工具生物信息学的工具基因相关性研究基因相关性研究基因功能基因功能药物设计和开发药物设计和开发潜在反义试剂开发潜在反义试剂开发个体

15、化医疗个体化医疗身份识别身份识别基因诊断基因诊断其他与生物有关的领域其他与生物有关的领域特定基因检测特定基因检测突变检测突变检测多态性分析多态性分析基因表达谱基因表达谱例：肿瘤诊断 国外有一临床病人表现出典型的白血病症状，但形态学检测不典型，根据相关检查，诊断为AML（acute myeloid leukaemia,急性骨髓白血病），治疗几个月后未见好转。后来用DNA芯片与病人骨髓的mRNA杂交，结果显示AML和ALL(acute lymphoblastic leukaemia 急性成淋巴细胞白血病)基因都表达较低，而在数据分析中发现，编码原肌球蛋白的基因表达极高，从而确诊为肺泡弹状肌肉瘤，改

16、变治疗方案，病情出现缓解。RNAi（RNA interference，RNA干扰）通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性抑制靶基因的转录后表达的现象，存在于从低等的线虫到人类培养细胞等多种有机体。RNAi相关技术是研究转录后调控的有效工具，可用于功能基因组学研究以及基因治疗等临床用途。RNAi 研 究 史十几年前，Rich Jorgensen 在矮牵牛花中发现转基因沉默七年前，researchers Guo 和Kemphues 注入反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-1 基因的表达；三年后，Fire等注入双链RNA到线虫中发现比注入单链更有效，随后发展了通过RNAi进行线虫基因

17、敲除的策略。近年来，显微注射，基因枪，基因工程手段诱导RNAi也成为果蝇研究中的反向遗传学工具。2001年Elbashir等 Nature上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。RNAi 机制模式图v核心技术：siRNA（Small interfering RNA）的设计与合成vsiRNA的标记vsiRNA的转染vRNAi的检测（核酸及蛋白水平）RNA干扰技术1.siRNA的一般结构：哺乳动物：21-23bp dsRNA 其它生物：更长的片段dTdT（UU）（UU）dTdTsiRNA的设计2.设计流程（选择siR

18、NA靶位点）从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点；根据5和3非翻译区（UTR)及靠近起始密码子（75个碱基之内）等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNA。将候选靶位点与相应的基因组数据库比较，去掉哪些与其它编码序列同源的靶序列。设计阴性对照：阴性对照siRNA应与siRNA的核苷酸组成相同但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNA核苷酸顺序并经同源序列比较确证而得。siRNA的设计RNAi技术的应用v 功能基因组学 蛋白表达调控，蛋白功能研究v 基因治疗 候选治剂；药物靶位点鉴定v 转录调控机理研究RNAi技术应用举例功能研究Anna M.Krichevsky*and Kenneth S.KosikRNAi functions in cultured mammalian neuronsPNAS u September 3,2002宿主：大鼠皮层和海马细胞靶基因：内源：MAP2/YB-1 外源：pEGFP/dsRed2 报告基因21nt GFP siRNA 在原代脑皮层神经元中的 RNAi21nt MAP2 siRNA在神经元中的 RNAiactin-bound phalloidin(red）