2015高通量测序专题培训：2015高通量测序培训课程-常见NGS方案实验流程及常见问题解析-讲义

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1、常见常见NGS方案实验流程方案实验流程及问题解析及问题解析魏冬凯魏冬凯2015.8.24Base Pair概要概要 常见NGS方案实验原理及流程介绍 常见问题解析 Hiseq测序仪相关知识及指标Base Pair概要概要 常见NGS方案实验原理及流程介绍 常见问题解析 Hiseq测序仪相关知识及指标Base Pair基因组学基因组学研究研究 基因组重测序 未知基因组测序 单细胞基因组测序表观遗传学研究表观遗传学研究 全基因组甲基化测序 MeDIP-Seq 简化甲基化测序免疫组学研究免疫组学研究 ChIP-Seq靶向区域研究靶向区域研究 全外显子组测序 靶向捕获测序 扩增子测序转录组学研究转录组

2、学研究 mRNA-Seq 全转录组测序 单细胞转录组组测序转录表达调控研究转录表达调控研究 sRNA-Seq转录因子研究转录因子研究 RIP-SeqDNA测序测序DNA文库文库cDNA测序测序Base PairNGS基本流程基本流程STEP1样本前处理样本前处理STEP2文库构建文库构建STEP3上机测序上机测序STEP4生物信息分析生物信息分析Base Pair样本前处理样本前处理样本前处理都做些什么？核酸提取（DNA/RNA)样本类型有哪些？1.人，动物的血液及器官组织等。2.植物（根茎叶，胚芽，种子等）。3.微生物（细菌，真菌）。Base PairDNA提取提取DNA提取的基本原理DNA

3、溶于水，在钠盐比在水中的溶解度较大。但但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。萃取萃取沉淀沉淀Base PairDNA在生物体中的存在形式在生物体中的存在形式DNA在细胞中常以核酸蛋白复合体（核蛋白）形式存在。Base PairDNA提取基本流程提取基本流程细胞破碎杂质去除沉淀DNA溶解DNABase PairDNA提取总原则提取总原则 保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。Base PairDNA提取方法概述提取方法概述人，动物组织（SDS法）人，动物全血，体液等（离心柱法）植物组织提取（CTAB法）质粒DNA（碱裂解法/离心柱法）线粒体/叶绿体

4、DNA（SDS差速离心法）Base PairDNA提取方法概述提取方法概述人，动物组织（人，动物组织（SDS法）法）人，动物全血，体液等（离心柱法）植物组织提取（CTAB法）质粒DNA（碱裂解法/离心柱法）线粒体/叶绿体DNA（SDS差速离心法）Base PairLysis Buffer样本样本破碎破碎细胞细胞裂解裂解56离心离心取上清取上清25:24:1酚氯仿异戊酚氯仿异戊醇醇Lysis Buffer离心离心取上清取上清24:1氯仿氯仿异戊醇异戊醇离心离心取上清取上清乙醇乙醇异丙醇异丙醇70%乙醇乙醇离心离心离心离心溶解溶解DNABase PairLysis Buffer（裂解缓冲液）（裂解

5、缓冲液）组分Tris-HCl(pH 8.0)EDTA(pH 8.0)SDSProteinaseK终浓度100mM50mM1%(w/v)加样本前加入200ug/ml加样本前加入Tris-HCl(pH 8.0)：提供碱性反应条件，防止DNA酸解。EDTA(pH 8.0)：大分子螯合二价阳离子，抑制DNase活性。SDS：去垢剂，破坏细胞膜，解离核蛋白，使蛋白质变性。Proteinase K：广谱蛋白酶，在SDS，EDTA存在下活性很高，高效催化蛋白质降解成多肽或氨基酸，释放DNA。Base Pair样本破碎样本破碎 尽量选取新鲜的组织样本，若是冷冻样本，避免反复冻融。研磨的整个过程必须保持低温。佩

6、带棉手套后必须佩带一层佩带棉手套后必须佩带一层PE手套，防止液氮冻伤！手套，防止液氮冻伤！Base Pair细胞裂解细胞裂解裂解需充分1.材料适量，过多的材料会导致裂解不充分，从而影响后续DNA得率低，质量差。2.消化过程中，定时轻轻震荡。3.温度55-60都可以。4.必要时，可消化过夜。Base Pair去除蛋白质去除蛋白质酚:氯仿:异戊醇（25:24:1 V/V）溶液酚：（被水或Tris-HCl 8.0饱和的酚）强烈的蛋白质变性剂，在初步纯化时，可有效的使蛋白质变性从而去除。异戊醇：消泡剂，帮助有机分相。Base Pair去除其他有机杂质去除其他有机杂质氯仿：异戊醇（24:1 V/V）氯仿

7、：1.高效蛋白质变性剂，具有高效溶脂性，可以有效去除脂类。2.本步骤中的氯仿可以萃取微量溶解在水相中的酚。异戊醇：消泡剂，帮助有机分相。Base PairDNA沉淀沉淀完整的基因组DNA（gDNA）片段大，可以直接使用2-3倍体积乙醇或0.6-1倍体积异丙醇常温加入并颠倒数次，即可看见成团白色沉淀。降解或片段偏小的DNA，可用预冷的乙醇或异丙醇进行沉淀，必要时可放置-20沉淀过夜。Base Pair盐离子去除盐离子去除70%乙醇DNA不溶于乙醇，盐离子溶解于水。Base PairDNA干燥干燥本步骤必须进行！乙醇残留会抑制PCR反应，酶反应等等。干燥时间一般控制在2-5分钟。不能过度干燥，否则

8、沉淀很难溶解！Base PairDNA溶解溶解长期保存DNA，建议用TE溶解，EDTA可抑制DNase活性。若需要立刻进行建库反应，可用水或Tris-HCl（pH 8.0）溶解。如果过度干燥导致沉淀溶解困难，可放置4轻度震荡过夜溶解。Base PairDNA质检质检 质检内容：浓度、纯度、完整性 质检所用方法：Qubit 2.0（荧光定量双链DNA技术）Nanodrop 分光光度技术（OD）DNA水平凝胶电泳 Base Pair浓度质检浓度质检NanoDrop也可以测浓度，为也可以测浓度，为什么什么一定要用一定要用Qubit？1.NanoDrop基于核酸紫外吸收原理，若有单链DNA，RNA或部

9、分蛋白，脂类也会影响紫外吸收，导致定量偏高。2.Qubit使用的荧光染料可以特异结合双链DNA，提高定量准确性。3.DNA纯度越高，NanoDrop定量结果与Qubit定量结果的差异就越小。Qubit与与PicoGreen有什么区别？有什么区别？1.都使用荧光染料定量双链DNA，从使用原理上没有根本性区别。2.PicoGreen可实现自动化，使用酶标仪进行定量。3.两者的定量范围相同，但Picogreen在使用低浓度标准曲线的状态下，对极微量的样本定量较为准确。Base Pair纯度质检纯度质检NanoDropOD260/OD280：核酸与蛋白的吸收比值OD260/OD230：核酸与糖的吸收比

10、值Base Pair完整度检测完整度检测琼脂糖水平凝胶电泳RNA污染Base PairDNA质检标准质检标准浓度 c 100ng/ul总量 m 2ugOD260/OD280：1.8-2.0OD260/OD230 2.0电泳图Base Pair文库构建文库构建为什么要构建文库？1.基因组必须要经过均一化处理之后，才能被测序仪识别。2.文库可以告知测序仪从哪个碱基开始识别。3.必须通过文库进行信号放大。Base Pair文库构建的总原则文库构建的总原则不能有其他外来物种污染。不能有接头二聚体。保证基因组覆盖完整度。扩增偏好尽量低。单个项目必须保证统一试剂，统一操作单个项目必须保证统一试剂，统一操作

11、！Base Pair基础基础文库构建流程文库构建流程STEP1DNA片段化STEP2末端修复加dATPSTEP3连接测序接头STEP4PCR扩增Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增打断方法打断方法打断范围打断范围特点及应用特点及应用Covaris System(AFA)100bp-500bp应用广泛，DNA测序主流打断方法Nebulizer400bp-800bp600bp以上文库构建HydroShear/g-TubeHydroShear2kb以上g-Tube2kb-20kb大片段文库构建Tn5转座酶100bp-8kb自动化文库构建Base PairDNA片段化

12、末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯化纯化目的：目的：纯化目的核酸片段，清除影响后续实验的分子污染，保证核酸纯度。纯化方法：纯化方法：1、传统的酚、传统的酚/氯仿抽提氯仿抽提 优点：适用性强，尤其可以纯化大片段。缺点：酚、氯仿都是对人体有害的物质；耗时长；对操作要求高 2、借助某些介质、借助某些介质 吸附柱离心法：纯度达到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修饰，捕获特定的DNA片段，分离不用离心，容易集成到生 物芯片上，实现样品处理自

13、动化和微型化。3、凝胶电泳、凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳胶回收、PAGE凝胶电泳等。在电泳后需要切胶回收，应用方法一或方法二。Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯化纯化目的：目的：纯化目的核酸片段，清除影响后续实验的分子污染，保证核酸纯度。纯化方法：纯化方法：1、传统的酚、传统的酚/氯仿抽提氯仿抽提 优点：适用性强，尤其可以纯化大片段。缺点：酚、氯仿都是对人体有害的物质；耗时长；对操作要求高 2、借助某些介质、借助某些介质 ：纯度达到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修饰，捕获特定的DNA片段，分离不用离心，容易集成到生 物芯片上，实现样品处理自

14、动化和微型化。3、凝胶电泳、凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳胶回收、PAGE凝胶电泳等。在电泳后需要切胶回收，应用方法一或方法二。吸附柱离心法Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增吸附柱离心法吸附柱离心法原理原理吸附膜主要成分硅胶、纤维，又称硅胶膜、硅胶柱。硅胶是一种多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，而硅氧烷分子含有硅醇基，其含量与其核酸的结合能力有关。在高盐、低PH值条件下，硅胶表面上的硅醇基释放出氢离子，通过高盐溶液中的阳离子与DNA的磷酸基团结合，DNA被吸附在硅胶膜上；相反在低盐、高PH值的条件下就会释放出DNA。纯化三原则：纯化三原则：不能混淆不能混淆样

15、本样本 不能污染不能污染样本、样本、试剂试剂 省时、省物省时、省物 Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增不要忘记加乙醇！不要忘记加乙醇！Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增纯化步骤纯化步骤片段化片段化DNA实验准备结合洗涤空转环吸及晾干洗脱10min50minBase Pair实验准备实验准备 清理桌面 准备试剂及耗材 离心管准备及标注：1.取吸附柱和离心管需用镊子。2.标注原则：名称要与待纯化样本完全相同，并且纯化后需标注“已纯化”类似字样，以便区分。3.标注要求：管盖及管壁均标注，且写在磨砂处。Base Pair样本结合样

16、本结合操作方法：加入5倍体积结合液PB混匀，转入吸附柱中，静置1min 操作要求：分别转移样品或者悬空滴加PB 尽量一个样本使用1个枪头 多次转移时，注意样本间交叉污染切记静置1min！Base Pair过柱及弃废液过柱及弃废液8000rpm，30sec倒废液：倒前准备吸水纸；切勿伸入废液瓶；沾液时不同样品管切勿使用同一位置。离心力不可过大！离心力不可过大！Base Pair洗涤洗涤操作方法：操作方法：加入加入740ml PW溶液溶液 8000rpm，30sec 倒倒废液（要求同前）废液（要求同前）操作操作要求要求：悬空悬空滴加滴加 尽量只使用尽量只使用1个枪头个枪头枪头一旦触碰样本，立刻弃掉

17、，严禁污染试枪头一旦触碰样本，立刻弃掉，严禁污染试剂！剂！Base Pair空转、环吸及晾干空转、环吸及晾干 操作方法：12000rpm，空转3min 环吸后晾干3min 操作要求：1.环吸方法：用小枪头对准管壁的余液，旋转枪头吸干余液。2.不可过度晾干！Base Pair洗脱洗脱操作方法：操作方法：加入 EB（Elution Buffer）静置5min（55孵育可提高回收率）12000rpm，2min 操作操作要求：要求：EB加在膜中央，加入后，环、壁上均无液体 在弃管前做最后核对，以免串样 Base Pair为什么要进行末端修复？随机打断后的DNA一般都会产生不规则的末端，无法直接进行测序

18、接头连接，因此需要进行末端修复。为什么要加dATP？为了提高连接效率，所以在测序接头的3端加1个dTTP，与Insert的dATP互补。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组DNA打断打断平端5端突出3端突出5端突出3端突出Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组DNA打断打断平端5端突出3端突出5端突出3端突出T4 DNA 聚合酶T4 DNA 聚合酶Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增已补平DNADNA磷酸化激酶PPAATaq聚合酶磷

19、酸磷酸化的目的化的目的填补连接缺口，提高连接效率填补连接缺口，提高连接效率本步骤温控程序本步骤温控程序25 30min72 20minPPBase PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增Illumina 接头接头Rd1 Seq PrimerP5Rd2 Seq PrimerIndexP7Y型接头的目的型接头的目的减少接头自连的可能性减少接头自连的可能性！TPBase PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增T4 DNA连接酶TPPT连接温控条件连接温控条件22 1hr连接反应需注意：连接反应需注意：1.反应时间不可过长。反应时间不可过长。2.测序接头要足

20、量。测序接头要足量。Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增连接反应后必须纯化的理由连接反应后必须纯化的理由1.去除接头二聚体（去除接头二聚体（128bp）2.筛选合适的片段大小筛选合适的片段大小纯化方法可选纯化方法可选1.电泳电泳+切胶筛选切胶筛选+胶回收胶回收2.磁珠纯化并筛选大小磁珠纯化并筛选大小Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增电泳 2%琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶，100V 1.5h同时选择多个片段大小同时选择多个片段大小胶回收（胶回收（Qiagen 离心柱法）离心柱法）Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测

21、序接头PCR扩增电泳的优点 1.成本低。2.可同时筛选多个大小。3.筛选范围可控，灵敏。电泳的缺点 1.不可自动化。2.小分子在分子迁移过程中易残留。3.DNA紫外灯下暴露易发生损伤。4.操作时间长。Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠 Ampure XP Beads(Beckman Coulter）Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠两步结合法筛选DNA片段大小Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠的优点1.可自动化，可重复性高。2.操作时间短。3.回收率高。4.可以高效去除小片段

22、。磁珠的缺点 1.成本高。2.筛选范围偏宽，不适合片段要求窄的文库构建。3.很难同时筛选多个大小。Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩增P5P5P7P795Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩增P5P5P7P795P5P7P5P7Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5P7P765P5 primerP7 primerBase PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5P7P755P5 primerP7 primer72Base PairDNA片段化

23、末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5P7P755P5 primerP7 primer72P5P5P7P7Rd1 SPRd1 SPRd2 SP IndexRd2 SP IndexBase PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增必须严格控制必须严格控制PCR循环数！循环数！过度过度PCR只会带来差的测序数据！只会带来差的测序数据！如果文库浓度不够，是不是可以多做几个如果文库浓度不够，是不是可以多做几个PCR循环？循环？Base PairDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增Base Pair文库质检文库质检一个好的文库应该符合哪些标准？1.完全没有接

24、头二聚体和引物二聚体。2.峰型呈正态分布，并在期望范围内。3.浓度满足上机需要即可，没有特别要求。4.不可出现过度PCR的大片段。Base Pair文库质检文库质检常见文库常见文库2100质检图质检图Base Pair质量差的文库质量差的文库引物二聚体引物二聚体接头二聚体接头二聚体文库文库过度过度PCR只占比只占比50%！Base Pair基因组学研究基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（De Novo）单细胞基因组测序（Single Cell）Base Pair基因组学研究基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（De Novo）单细胞基因组测序（Single C

25、ell）研究对象：有参考基因组的物种。研究方法：建库：最基本的DNA文库构建方法。测序方案：个体测序一般30X，种群测序一般6XBase Pair基因组学研究基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（De Novo）单细胞基因组测序（Single Cell）研究对象：无参考基因组的物种，物种的种群最好不要过大。研究方法：建库：基本DNA文库，长片段（Mate-Pair)文库，必要时需要构建Fosmid或BAC文库。测序方案：按照文库长度递增。Base PairDe Novo大致流程大致流程Base Pair基因组学研究基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（De No

26、vo）单细胞基因组测序（Single Cell）研究对象：主要是人的1个或者几个细胞或者极少量DNA研究方法：建库：单细胞扩增（MALBAC）+基本DNA文库测序方案：全基因组测序30XBase Pair为何选择为何选择MALBAC？检验方法：检验方法：1.采用采用9对持家基因对扩增对持家基因对扩增产物进行产物进行qPCR2.MALBAC与与MDA各做各做3个生物学个生物学重复重复Base Pair靶向区域研究靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序扩增子测序Base Pair靶向区域研究靶向区域研究全外显子组测序（Whole Exome Sequencing）靶向捕获测序扩增子测序研究对象：主

27、要是人，Roche芯片现有一些特殊物种。研究方法：建库：基本DNA文库+外显子杂交芯片捕获测序方案：100XBase Pair杂交平台杂交平台探针携带生物素标记。捕获富集的片段用亲和链霉素磁珠进行筛选。Roche V3.0 64MbAgilent V5 54MbBase Pair外外显显子子基基本本研研究究策策略略Nature Genetics，2009Base Pair靶向区域研究靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序（Target Sequencing）扩增子测序研究对象：主要是人，捕获用的探针是根据自身需要订制的。研究方法：建库：基本DNA文库+订制探针杂交芯片捕获测序方案：200X以上

28、比外显子测序所需数据量更少，比外显子测序所需数据量更少，大幅提高测序深度，降低测序大幅提高测序深度，降低测序成本！成本！Base Pair靶向区域研究靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序扩增子测序（Amplicon）研究对象：主要是人，使用扩增特异性引物扩增目的片段。研究方法：建库：扩增目的区域+DNA建库测序方案：200X以上通量较小，适合几个基因或较通量较小，适合几个基因或较少位点的研究。少位点的研究。PCR容易引入人为错配，增加容易引入人为错配，增加分析噪音。分析噪音。Base Pair表观遗传学研究表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RR

29、BS）Base Pair 表观遗传学研究表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）研究对象：主要是人，人源细胞等。研究方法：建库：DNA建库+重亚硫酸盐处理测序方案：30X以上Base Pair表观遗传学研究表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）研究对象：主要是人，人源细胞等。研究方法：建库：DNA建库+5mC抗体包被磁珠处理测序方案：50X以上Base Pair表观遗传学研究表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）研究对象：主要是人，小鼠

30、，大鼠。研究方法：建库：MspI酶切+DNA建库+重亚硫酸盐处理测序方案：50X以上Base Pair免疫组学免疫组学研究研究ChIP-Seq（染色质免疫共沉淀测序）研究对象：主要是人，人源细胞等。研究方法：建库：染色质免疫共沉淀+DNA建库测序方案：50X以上Base Pair转录组学转录组学研究研究mRNA-Seq全转录组测序单细胞转录组组测序Base Pair转录组学转录组学研究研究mRNA-Seq全转录组测序单细胞转录组组测序研究对象：所有真核生物，没有特别限制的物种。研究方法：建库：mRNA富集+反转录+DNA建库测序方案：100X以上Base Pair转录组学转录组学研究研究mRN

31、A-Seq全转录组测序（去除rRNA，包括原核生物）研究对象：原核生物，人源微生物，人，小鼠，大鼠，植物。研究方法：建库：去除rRNA+反转录+DNA建库测序方案：100X以上Base Pair转录组测序转录组测序 RiboMinus/Ribo-zeroLifeTech/EpicentreRibo-Zero OR RiboMinus?WO 2011/019993 PCT/US2010/045437全转录组测序 Base Pair转录组学转录组学研究研究mRNA-Seq全转录组测序单细胞转录组组测序研究对象：主要是人，人源细胞。研究方法：建库：SMART技术+DNA建库测序方案：100X以上Ba

32、se Pair转录表达调控转录表达调控研究研究sRNA-Seq研究对象：主要为人，小鼠，大鼠。研究方法：建库：小RNA建库技术测序方案：100X以上Base Pair转录因子转录因子研究研究RIP-Seq（RNA免疫共沉淀测序）研究对象：主要为人源细胞。研究方法：建库：RIP+RNA反转录+DNA建库测序方案：100X以上Base PairBase Pair概要概要 常见NGS方案实验原理及流程介绍 常见问题解析 Hiseq测序仪相关知识及指标Base PairDNA提取中的常见问题提取中的常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原原因因1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质

33、 2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 3.DNA中残留有金属离子 解决方案解决方案1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 3.增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）Base PairDNA提取中的常见问题提取中的常见问题问题二：DNA降解。原原因因1.材料不新鲜或反复冻融 2.未很好抑制内源核酸酶的活性 3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 4.外源核酸酶污染 解决方案解决方案1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 3.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 4.所有试剂用无菌水配

34、制，耗材经高温灭菌 Base Pair问题三：DNA量太少DNA提取中的常见问题提取中的常见问题原原因因1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时DNA丢失 解决方案解决方案1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 2.动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 3.裂解时，时间延长，可过夜 4.低温沉淀，延长沉淀时间 5.加辅助物，促进沉淀 6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒DNA提取遇到的问题，大多提取遇到的问题，大多数都来自于裂解不完全！数都来自于裂解不完全！Base Pair文库构建的常见问题文库构建的常见问题DNA片段化问题片段化问题1

35、.DNA量过大2.DNA质量差3.溶解buffer粘稠度过高4.Covaris使用不当原原因因解决解决1.每次打断不超过10ug2.严格执行DNA质检标准3.使用水或TE溶解DNA4.循环水位应在8以上5.循环水温度应在4-86.开启机器后，需排气30min以上Base Pair问题一：打断DNA之后纯化产物浓度过低文库构建的常见问题文库构建的常见问题原原因因1.DNA初始定量出错2.使用Nanodrop进行DNA初始定量。3.纯化步骤中操作错误。解决方案解决方案1.使用Qubit定量样本前，同一项目样本必须重做标准品。2.浓度过高的样本，需要稀释后定量。3.检查Qubit标准品的检测值是否在

36、正常范围。4.初始DNA定量必须使用荧光定量方法(Qubit/Picogreen/qPCR)5.PW液在使用前没有加乙醇。6.洗涤液和结合液混淆。Base Pair问题二：连接测序接头后纯化无产物文库构建的常见问题文库构建的常见问题原原因因1.磁珠使用不当。2.切胶纯化时，操作失误。解决方案解决方案1.磁珠使用前必须放置在室温下预热半小时以上。2.80%乙醇必须新鲜配置。3.磁珠洗脱液一定要使用EB或者RSB，不可用水。4.胶块没有完全溶解。5.PW液没有加乙醇就使用。6.PW和PB混淆。7.磁珠干燥时间过长。Base Pair问题三：构建出的文库有接头二聚体。文库构建的常见问题文库构建的常见

37、问题原原因因1.连接反应时间过长。2.连接反应用的接头量过大。3.连接反应时DNA量已经很少。4.跑胶进行片段筛选前没有用磁珠纯化。5.磁珠纯化比例错误。解决方案解决方案1.连接反应时间必须严格控制。2.连接反应必须终止，可以采用热终止或EDTA。3.接头量必须严格控制，如果DNA量过少，必须减少接头用量。4.跑胶前必须先用磁珠1:1进行纯化。5.磁珠纯化比例为DNA：磁珠=1:1或者可以适当减少磁珠用量，切勿增大！Base Pair文库构建的常见问题文库构建的常见问题打断的打断的DNA300bp文库文库740bp问题问题四：连接产生了嵌合体四：连接产生了嵌合体(cross mapping)根

38、本原因：连接导致！根本原因：连接导致！1.连接温度过高。2.连接反应时间过长。3.接头过少。4.某些AT极端偏好的物种。解决方法：1.严格控制连接反应时间和温度。2.定期检查接头浓度，接头一定要足量。3.打断DNA后增加筛选大小步骤。4.采取一些有针对性的建库手段。Base Pair问题四：文库后不正常的大片段？文库构建的常见问题文库构建的常见问题原因：1.连接反应时间过长。2.PCR循环过多！3.磁珠筛选时操作不当。解决方法：1.严格控制连接反应时间和温度。2.PCR循环一定要严格遵守操作规则。3.磁力架磁力不足，磁珠容易掉落。4.反应产物过多，磁珠偏少。Base Pair一些较差的文库示例

39、一些较差的文库示例操作不当是导致操作不当是导致文库构建失败最文库构建失败最根本的原因！根本的原因！Base Pair概要概要 常见NGS方案实验原理及流程介绍 常见问题解析 Hiseq测序仪相关知识及指标Base PairSolexa测序原理测序原理Base Pair准备DNA片段两端接上 adapters将DNA片段通过adapter锚定在芯片上循环扩增DNA片段成“DNA簇”20 micronsSequenceCluster形成形成Base Pair可逆终止反应可逆终止反应Reversible Terminator ChemistryO PPPHNNOO荧光基团3保护基团Next cycl

40、e掺入检测去保护基团 去荧光基团ODNAHNNOO3O5游离3末端XOH4种标记过的核苷酸测序测序Base PairSequencing-by-Synthesis(SBS)5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTA掺入一个碱基Cycle 1:加入反应体系移除其他未掺入的核苷酸信号检测Cycle 2-n:加入反应体系，循环cycle 11、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的保护基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团和荧光基团，进行下一轮测序反应测序测序Base Pair12378

41、9456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列通过荧光信号分析核苷酸序列测序测序Base Pair测序种类测序种类Single-Read Sequencing(SR)Base Pair测序种类测序种类Single-Read Sequencing(SR)Base Pair测序种类测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Sequencing(PE)Base Pair测序种类测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Se

42、quencing(PE)Base Pair测序种类测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Sequencing(PE)Index Sequencing(PE)Base Pair测序种类测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Sequencing(PE)Index Sequencing(PE)Base Pair测序种类测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Sequencing(PE)Index Sequencing(PE)Base PairHiseq2500Base P

43、air1个个flowcell 8个个lane2个个flowcellBase PairHiseq2500的关键系统的关键系统 光路系统(Optical System)流路系统(Fluidics System)温控系统(Temperature Control System)Base Pair光路系统光路系统红色激光：A，C绿色激光：G，T其中G碱基信号最弱Base Pair常见的光路问题常见的光路问题Autotilt正常正常异常异常Base PairFocus常见的光路问题常见的光路问题正常正常异常异常Base Pair流路系统流路系统Base Pair常见的流路问题常见的流路问题气泡气泡异常异常

44、Base Pair温控系统温控系统Flowcell温控Hiseq冷却系统试剂温控Base Pair常见的温控问题常见的温控问题Base Pair如何监控如何监控1个个run？SAV（Sequencing Analysis Viewer)Base PairSAV所需文件所需文件 InterOp（文件夹）RunInfo.xml runParameters.xmlBase PairBase PairBase PairBase Pair测序质量差常见因素汇总测序质量差常见因素汇总文库质量差！测序信号低激光器问题滤光片偏移前4个碱基不均匀测序噪音高流路脏温控问题Base PairQuestion谢谢！谢谢！