乙型肝炎病毒的异质及临床意义

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1、Partially double-stranded DNAA(n)附着和侵入？附着和侵入？(-)-DNA分泌？分泌？mRNAcccDNA的形成？的形成？DNA polRT核心包装？核心包装？HBV移行？移行？外外膜膜装装配配？HBV的感染过程的感染过程Gene Therapy Research Center,BeijingGene Therapy Research Center,BeijingHBV的基因组结构 HBV基因组为部分双链环状基因组为部分双链环状DNA，长度长度3.2kbDR2DR1Gene CPreCPreS1PreS2Gene SRegion PRegion X+strand-

2、strand HBV基因型的定义 分型方法是根据HBsAg主蛋白基因或全基因组核苷酸序列差异性进行的基因型分型，差异大于8%即被确定为另一基因型，按照这种分型方法，将HBV分为6种基因型，分别命名为A-F型，另有学者新定义了G、H型，尚待确定。国内流行病学资料 国内主要的基因型为B、C两型，台湾省的研究资料提示除E型外，其他基因型均可在华人HBV感染者中检出，B和C型占患者人群的85%。HBV HBV 的异质性的异质性 基因型基因型 Chu CJ et al.Hepatology 2002;35(5):1274型与准种型与准种 基因型基因型 （不同个体之间）（不同个体之间）血清型血清型 （不同

3、个体之间）（不同个体之间）准准 种种 （单一个体）（单一个体）为什么以前没有注意？为什么以前没有注意？方法比较方法比较既往方案：既往方案：收集血清收集血清提取血清中提取血清中HBV DNA设计重叠设计重叠PCR引物引物PCR扩增扩增产物直接测序产物直接测序（单一克隆序列单一克隆序列）本研究方案本研究方案收集血清收集血清提取血清中提取血清中HBV DNA设计设计PCR引物引物PCR扩增扩增 TA克隆入质粒载体中克隆入质粒载体中随机选择单克隆测序随机选择单克隆测序（多个克隆序列）（多个克隆序列）Protocol of Human Somatic Gene Therapy S 基因全长基因全长 PC

4、R,1400 bp 1 2 3 4 M 5 6 71 400 bpHBVHBV全全S S基因基因RFLPRFLP结果结果遗传树分析E853-A3E845-A12E845-B4E845-A16E845-A8Renbao GanN19 E5N19 A3N19 A8N19 E19EJ1 B13 EJ1 A4E67 B5E67 A1E67 A8E67 B1E67 B8N19 E5EJ1 B6EJ1 A12EJ1 B16HBVHBV准种特点分析准种特点分析 HBV DNA S Region HBV DNA X Region HBV DNA P Region HBV DNA C Region HBV DN

5、A Pre-C 区区 HBV DNA 全长全长 HBV DNAHBsAgHBsAg氨基酸序列氨基酸序列RT702 A3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT702A14 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT702 B3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT702A10 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT522 B7 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG-RT522 A5 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG-RT522B11 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG-RT XJ A2 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-R

6、T XJ A6 MENTT-LFGEA-VPFVQ*FVG-RT XJ B5 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-RT XJ C4 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-变异的一些特点（逆转录酶区）变异的一些特点（逆转录酶区）RT702 A3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-RT702A14 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-RT702 B3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-RT702A10 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQE

7、HIVLKIK-RT522 B7 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK-RT522 A5 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK-RT522B11 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK-RT XJ A2 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-RT XJ A6 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-RT XJ B5 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-RT XJ C4 -

8、SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-HBVHBV在慢性患者人群中的准种现象在慢性患者人群中的准种现象前前-S2S2区缺失突变分析区缺失突变分析 总数总数 无缺失无缺失 缺失百分比缺失百分比HBeAg 阳性 36 23 13（36%）抗-HBe 阳性 15 1 14（93%）合计 51 24 27（52%）前前-S2-S2区缺失突变位点分析区缺失突变位点分析 位点位点 范围范围 702-4 nt 43-66 24 bp ZH-A6 nt 52-66 15 bp ZH-B4 nt 37-66 30 bp ZH-B12 nt 37-66 30 bp N314-5

9、 nt 25-66 42 bp N314-7 nt 25-66 42 bp 811-B12 nt 52-66 15 bp不同病毒株突变位点adr MQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPN702-1 -A-I-H702-4 -A-I-702-9 -G-A-T-I-702-10 -G-A-T-I-314-1 -T-Q-L-I-314-5 -L-314-7 -L-314-9 -T-Q-ZH-A6 -Q-ZH-B4 -ZH-B6 -ZH-B11 -ZH-B12 -142-A3 -142-A7 -142-A8 -H811-A7 -81

10、1-A8 -811-B12 -本研究的一些重要发现 慢性乙肝患者体内存在有慢性乙肝患者体内存在有HBVHBV准种群。准种群。HBVHBV准种群中存有缺陷型病毒，即部分准种群中存有缺陷型病毒，即部分ORFORF编码序列经突变终止了正常表达。编码序列经突变终止了正常表达。前前C/CC/C区、区、X X区、前区、前-S2-S2区内部存有缺失突变，区内部存有缺失突变，尤其以后尤其以后2 2个区域多见。个区域多见。HBVHBV变异存在个体化现象变异存在个体化现象。血液中发现了截短型表面抗原中蛋白血液中发现了截短型表面抗原中蛋白 关于准种研究的一些问题关于准种研究的一些问题 乙型肝炎病毒的高变区与高保守区

11、的界定？乙型肝炎病毒的高变区与高保守区的界定？乙型肝炎病毒准种与感染慢性化的关系？乙型肝炎病毒准种与感染慢性化的关系？乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝纤维化的关系？乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝纤维化的关系？乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝细胞癌的关系？乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝细胞癌的关系？干扰素治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？干扰素治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？拉米夫定治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？拉米夫定治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？耐药株与准种漂变规律的关系？耐药株与准种漂变规律的关系？需要多靶位的需要多靶位的“联合、序贯联合、序贯”的治疗？的治疗？拉米夫定对野生型拉米夫

12、定对野生型HBV的抑制的抑制核苷类似物核苷类似物拉米夫定拉米夫定ss(-)DNA抑制抑制HBV 聚合酶聚合酶(野生型野生型)高亲和力高亲和力MDYDY=酪氨酸酪氨酸M=蛋氨酸蛋氨酸D=天门冬氨酸天门冬氨酸拉米夫定和拉米夫定和 YMDD 变异株变异株HBVY=酪氨酸酪氨酸V=缬氨酸缬氨酸D=天门冬氨酸天门冬氨酸 I =异亮氨酸异亮氨酸核苷类似物核苷类似物拉米夫定拉米夫定ss（-）DNA弱抑制弱抑制HBV 聚合酶（变异株）聚合酶（变异株）亲和力下降亲和力下降VDYD在细胞培养体系中在细胞培养体系中YMDD变异株复制水平显著低于野生株变异株复制水平显著低于野生株（Melegari et al，Hepatology 1998;Allen et al,Hepatology 1998）YMDD 变异株变异株（YVDD and YIDD）与核苷类似物的结合能力显著下降与核苷类似物的结合能力显著下降(Chayama et al，Hepatology1998;Back et al，EMBO J，1996)新北京地坛医院全貌图新北京地坛医院全貌图由近及远：行政办公楼、门诊医技楼、病房楼由近及远：行政办公楼、门诊医技楼、病房楼