版中国药典微生物检验主要增修订内容

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1、2010年版中国药典微生物检验主要增修订内容浙江省食品药品检验所王知坚2增修订背景 药品微生物限度检查、无菌检查各论标准化的研究 药品微生物限度检查用培养基灵敏度检查方法的研究 中国药典与国外药典细菌计数方法的比较 离心集菌法标准化的研究 贴膏剂微生物限度检查法的研究 大肠菌群检查用培养基的比较 白色念珠菌检查法的研究 防腐剂效力测定方法的研究 药品微生物检验替代方法验证的方法研究 3浙江所承担的主要工作 科研工作药品微生物检验替代方法验证的方法研究 药品微生物限度检查、无菌检查各论标准化的研究 药品微生物限度检查用培养基灵敏度检查方法的研究 中国药典与国外药典细菌计数方法的比较 大肠菌群检查

2、用培养基的比较 附录增修订工作药品微生物检验替代方法验证指导原则 4主要成果 药品微生物限度检查和无菌检查的各论标准化 修订了无菌检查法 增修订了微生物限度检查法 修订了一个指导原则灭菌法 新增了四个指导原则抑菌剂效力检查法指导原则药品微生物实验室规范指导原则微生物限度检查法应用指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则5各论标准化 微生物限度检查各论富马酸酮替芬滴鼻液 【微生物限度】取本品10ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数：取供试液，采用培养基稀释法（0.2ml/皿），依法检查（附录XI J），应符合规定。控制菌：取规定量供试液，依法检

3、查（附录XI J），应符合规定。6各论标准化聚维酮碘溶液 【微生物限度】取本品10ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数：取供试液，用平皿法测定菌数，浇注含4硫代硫酸钠（W/V）的计数用培养基，依法检查（附录XI J），应符合规定。控制菌：取规定量供试液，接种至含4硫代硫酸钠（W/V）的增菌培养基中，依法检查（附录XI J），应符合规定。7各论标准化 无菌检查各论亚叶酸钙注射液 【无菌】取本品，采用薄膜过滤法处理，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（附录XI H），应符合规定。注射用泮托拉唑钠【无菌】取本品，用0.9无菌氯化钠溶液溶解，经薄膜

4、过滤法处理，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（附录XI H），应符合规定。复方庚酸炔诺酮注射液【无菌】取本品，加含1聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释，经薄膜过滤法处理，用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗（每膜不少于100ml），以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（附录XI H），应符合规定。8各论标准化甲硝唑注射液 【无菌】取本品，经薄膜过滤法处理，用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分次冲洗（每膜不少于500ml），以生孢梭菌为阳性对照菌，依法检查（附录XI H），应符合规定。注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠【无菌】取本品，加0.9%无菌氯化钠溶液溶解并制成每1ml中约

5、含40mg的溶液，经薄膜过滤法处理，用无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分次冲洗（每膜不少于500ml），以大肠埃希菌为阳性对照菌，依法检查（附录 H），应符合规定。9无菌检查法 前言部分 培养基 灵敏度检查 稀释液、冲洗液等 方法验证 薄膜过滤法 培养及观察 结果判断 表1、表2和表310 前言部分规定了防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出规定了日常检验还需要对环境进行监控对无菌检查的人员资质提出了要求11 培养基删除了硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧菌的规定删除了改良马丁培养基用于培养真菌的规定12 灵敏度检查修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法，规定应使用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0

6、.9无菌氯化钠溶液稀释规定了稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限13 稀释液、冲洗液等规定可根据供试品的特性，选用其他经验证的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液14 方法验证标准菌种的选择上，删除了铜绿假单胞菌，增订了大肠埃希菌明确规定了薄膜过滤法验证时，应取每种培养基规定接种的供试品总量用于过滤15 薄膜过滤法增订了抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜的规定对每片滤膜的总冲洗量进行了规定，不得过1000ml修订了无菌气（喷）雾剂供试品的检验方法，规定冰室的温度应至少为-20对装有药物的注射器供试品的检验方法进行了详细的规定16 培养及观察对于培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长的情况，删

7、除了可划线接种于斜面培养基上的规定，同时删除了可根据斜面是否有菌生长而判断的规定17 结果判断增订了阳性对照管和阴性对照管的实验结果对于整体实验结果判断的作用18 表1、表2和表3表1 修订了注释项，对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍表2修订了表格名称，明确了该表格用于确定液体制剂的最少检验量修订了注释项，对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍表3修订了表格名称，明确了该表格用于确定固体制剂的最少检验量修订了注释项，对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍19微生物限度检查法 前言及检验量 供试液制备

8、计数实验的培养基适用性 计数实验的方法验证 计数实验的操作方法 控制菌检查的培养基适用性 控制菌检查的方法验证 控制菌检查的内容 标准体系20 前言及检验量前言中修订了控制菌检查的温度，规定与细菌计数实验温度相同，均为3035前言中增订了对于特殊品种可以最小包装单位报告的规定检验量中对要求进行沙门菌检查的供试品，其检验量应增加20g或20ml的规定21 供试液制备增订了贴剂供试品的制备方法修订了离心沉淀法，删除了高速离心的规定，并对该方法的使用范围进行了限定22 计数实验的培养基适用性该部分内容均为新增规定了该内容的应用范围采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法标准菌种为：大肠埃希菌、

9、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；规定了稀释后的工作菌液的保存条件和保存期限引入了对照培养基的概念判定的依据：回收率大于70，且形态一致23 计数实验的方法验证增订了常见干扰物的中和剂或灭活方法的参考表格对采用多种方法仍无法得到满意验证结果的情况，提供了两种办法允许使用更高稀释级的供试液进行方法验证实验，并以该稀释级供试液作为最低稀释级供试液进行供试品检验允许选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验24 计数实验的操作方法平皿法删除了应取23个连续适宜稀释级供试液进行检验的规定细菌培养时间延长为3天，霉菌、酵母菌培养时间延长为5天；规定必要时均可延长至7天菌数报告

10、规则进行了修订：计数不再设置下限；以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告供试品中所含的菌数薄膜过滤法滤膜直径调整为约50mm，并规定若采用其它直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整总冲洗量规定不得超过1000ml25 控制菌检查的培养基适用性该部分内容均为新增规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目采用标准菌种比较的判定方法根据培养基的用途不同，分为增菌培养基的促生长能力、固体培养基的促生长能力、培养基的抑制能力、固体培养基的指示能力、液体培养基的指示能力等5种检查方法在检查中引入了涂布接种的概念26 控制菌检查的方法验证删除了阴性菌对照组的概念27 控制菌检查的内容所有的生化试验均修订为鉴定试验

11、大肠菌群的培养基进行了修订，现改用乳糖胆盐发酵培养基梭菌的增菌培养基修订为梭菌增菌培养基，删除了庖肉培养基增订了白色念珠菌检查法，并增订了与之相关的培养基28 标准体系菌落计数单位从“个”修订为“cfu”阴道、尿道给药制剂增订了白色念珠菌控制要求直肠给药制剂删除了大肠埃希菌的控制要求29灭菌法 前言 湿热灭菌法 过滤除菌法 生物指示剂的制备30 前言修订了灭菌法的定义，强调灭菌法的作用是使被灭菌物品中残存微生物的概率下降至某一预期水平，从而突出了灭菌不是绝对的这一理念。修订了无菌保证水平的表述方式，强调其含义在于物品中活微生物的概率降低至某个可接受的水平。明确了对于最终灭菌物品而言，其微生物存

12、活概率，即无菌保证水平不得高于百万分之一。在选择确定灭菌工艺时，增订了应考虑灭菌后物品的稳定性的规定。31 湿热灭菌法增订了选择湿热灭菌条件时应综合考虑的因素，如灭菌物品的热稳定性、热穿透力以及微生物污染程度等修订了F0值的概念，突出了等效121标准灭菌时间的含义规定当选用F0值概念进行灭菌程序控制时，除了对灭菌程序进行验证外，还必须在生产过程中对微生物进行监控，证明其数量低于设定的限度对热不稳定物品，强调应在生产全过程对产品中污染的微生物进行连续监控，并防止耐热菌的污染。规定这一类产品的F0值一般不低于8min，删除了“如产品的热稳定性很差时，可允许湿热灭菌的F0低于8”的规定。32 过滤除

13、菌法对过滤器孔径的定义进行了说明，强调孔径与微生物的截留性能有关，而不是平均孔径的分布系数根据滤器孔径的定义，规定用于最终除菌的过滤器，必须选择除菌级过滤器，并应提供截留实验证明对过滤器的稳定性以及与被过滤液体的相容性进行了规定，明确过滤器使用者具有了解并评估这些性能的责任增订了滤膜完整性测试的标准，指出该测试标准应来自于相关细菌截留实验的数据规定了过滤操作的生产环境无菌环境，将原标准中的“建议”修订为“应”33 生物指示剂的制备规定生物指示剂在制备完成后，应测定D值和孢子总数。34抑菌剂效力检查法指导原则 前言 产品分类 培养基 测定方法35 前言规定了本指导原则的用途：测定抑菌剂活性，评价

14、抑菌效力；指导制剂研发中抑菌剂的选择指出由于抑菌剂存在一定毒性，故制剂中抑菌剂的量应为最低有效剂量指出本指导原则用于包装未开启的成品制剂36 产品分类根据不同用途产品对微生物污染风险耐受程度的差异，将产品分成四类：1类：注射剂、其他费肠道制剂，包括乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂2类：局部给药制剂、非无菌鼻用制剂及用于黏膜的乳剂3类：口服非固体制剂（非抗酸制剂）4类：非固体抗酸制剂37 培养基培养基不同与微生物限度检查法，主要采用TSB和TSA用于细菌生长，沙氏葡萄糖肉汤和琼脂培养基用于真菌生长培养基适用性检查标准菌种与微生物限度检查略有不同，使用铜绿假单胞菌代替枯草芽孢杆菌38 测定方

15、法菌种来源：除了培养基适用性检查中的菌种外，允许使用制剂中常见的污染微生物菌液制备：允许使用固体或液体培养基制备工作用菌种，并采用比浊法制备每1ml中含108cfu的菌悬液供试品接种：容器选择以供试品原包装容器为首选，当供试品性状、装量等因素限值时，允许将供试品转移至其他无菌容器中，但转移应不影响供试品的特性。取供试品至少5份，接种试验菌，根据供试品类别不同，试验菌的接种量有所区别，体积不得过供试品体积的0.51，放置温度为2025，应避光39存活菌数测定可使用平皿法或薄膜过滤法测定细菌用TSA，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基测定方法必须进行验证测定结果应进行对数转换结果判断：与初始值进行比较

16、，并判断是否符合规定40药品微生物实验室规范指导原则 前言 人员 培养基 菌种 实验室的布局和运行 设备 文件 实验记录 结果的判断41 前言规定了该指导原则用于指导质量控制指出制订实验室规范的必要性 人员人员的专业背景人员培训应覆盖仪器设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等应通过内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法评估检验人员的能力42 培养基培养基的制备应按处方配制培养基，也可使用市售的脱水培养基配制培养基的水应该是纯化水培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术，特殊培养基可采用薄膜过滤除菌培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。应对高压灭菌器的蒸汽循环系统进行验证，确保在一定装载方式下的正常

17、热分布应确定每批培养基灭菌后的pH值（25下测定）应对分装后的培养基进行质量检查，并记录批数量、有效期及无菌情况等信息43培养基的贮藏自配培养基应标记名称、批号、配制日期等信息，商品化的成品培养基应标记名称、批号、生产日期和失效期等信息。灭菌后的培养基应尽快从灭菌器内取出，琼脂培养基应防止冷冻，容器应密闭，防止水分流失；琼脂平板宜临用新配，如置冰箱保存，一般不超过一周，如需延长，则应对保存期进行验证。固体培养基灭菌后只允许再融化一次，一般采用水浴加热或流通蒸汽的方式，如使用微波炉，应避免过度加热和水分流失。融化后的培养基应置4550的水浴中保温，时间不得超过8小时。44培养基的质量控制试验实验

18、室应制订培养基质量控制程序所有配制好的培养基均应进行质量控制试验培养基质量控制的项目有：pH值、适用性检查和定期的稳定性检查当培养基的配制和灭菌程序等均已验证，则同一批次的脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次用于环境监控的培养基须特别防护，用于关键区域监控的培养基宜双层包装和终端灭菌，以防出现假阳性45 菌种菌种的来源：已认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株由标准菌株复活得到的为标准储备菌株；应对标准储备菌株进行纯度和特性确认；建议采用冻干、液氮或超低温保存的方法使用标准储备菌株制备工作菌株冷冻菌株解冻后，不得重新冷冻和再次使用工作菌株的传代次数

19、不得超过5代代的定义：活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次实验室应建立文件化的程序管理菌种（从标准菌株到工作菌株）46 实验室的布局和运行实验室布局的原则：最大程度防止微生物的污染，防止检验过程对环境和人员造成危害实验室应具备：满足无菌检查、微生物限度检查和无菌采样等活动的独立设置的洁净室（区）或隔离系统；配套的细菌（真菌）实验室、培养室、准备区、样品接受和贮藏区、标准菌株贮藏区、污染物处理区和文档处理区等辅助实验室；上述区域应明确标识应建立洁净区的使用、维护、验证等活动的标准操作规程实验室的操作应避免交叉污染应建立实验室生物安全的应急控制预案

20、应建立微生物实验废弃物的处理规程47 设备微生物实验室所用的仪器设备应定期校准，并记录培养箱、冰箱等重要设备应确保状态正常，并有措施保证其工作的连续性培养箱、冰箱、灭菌器等应对关键参数进行连续观测和记录，应评估发生的偏差对实验结果的影响水浴锅、培养箱、冰箱和生物安全柜等应定期清洁和消毒无菌器具应有明显的标识48 文件一般包括以下内容人员培训与资格确认设备验收、检定（校准、期间核查）和维修设备关键参数和使用记录（如24小时或7天记录图）培养基制备、贮藏和质量控制检验过程中的关键步骤数据记录与结果计算数据偏离的调查49 实验记录原始记录至少包括以下内容实验日期检品名称实验人员姓名实验方法实验结果偏

21、差（存在时）实验参数（设备、菌种、培养条件、培养基信息等）签名50 结果的判断主要是对不符合标准的结果进行判断导致不符合的原因实验过程中的污染样品污染了超过限度标准的微生物对前一种原因，应充分考虑实验室环境、抽样条件、样品检验过程等环节如确定为第一种原因，则应判结果无效，重新进行实验对重试应加以监控51微生物限度检查法应用指导原则 制订该指导原则的目的在于指导对微生物限度检查法的应用，是对该检查法某些未尽事宜的说明 主要对以下内容进行了说明应采用产品中可能污染的微生物进行表面活性剂、灭活剂、中和剂等的毒性试验应选择操作简便、快速的检验方法，避免对微生物的损伤；去除抑菌作用首选薄膜过滤法对离心法

22、限制使用的原因作出了解释52对培养基适用性实验中提到的对照培养基作出了说明，并指出由中检所提供。对方法验证中允许使用更高稀释级供试液进行验证作出了解释，指出应根据产品的微生物限度确定更高稀释级的上限对供试品中检出疑似菌的情况，指出应采用被认可的菌种鉴定方法明确了附录收载的“药品微生物限度标准”的法律地位53对制剂通则中没有规定必须进行微生物限度检查的四种制剂进行了说明，并指出这些制剂中如有必要进行微生物限度检查则应在产品标准的各论中予以规定对于难以判断创伤程度的局部给药制剂，在没有证据证明产品不存在安全风险的情况下，应符合无菌检查法的要求。对动物药的来源进行了说明，如包括：牡蛎、珍珠、海蜇、冬

23、虫夏草和人工牛黄等制订产品微生物限度的标准除了依据附录收载的标准外，还应该综合考虑原料来源、性质、生产工艺、给药途径及对患者潜在的风险，因此，对某些特殊的产品，应制订更严格的限度标准54药品微生物检验替代方法验证指导原则 前言 微生物检验的类型及验证参数 替代方法验证的一般要求 定性检验方法的验证 定量检验方法的验证55 前言目的在于对如何开展替代方法的验证提供指导介绍了可供选择的替代方法的主要类别，强调了这些方法与传统方法相比具有的优势明确了药品微生物检验实验室可以使用替代方法，但需要对替代方法进行验证，以证明其应用效果优于或等同于药典的方法56 微生物检验的类型以及验证参数根据药品微生物检

24、验的特点，确定微生物检验的类型主要包括：定性实验和定量实验主要的验证参数与分析方法验证中的表述基本一致，但都根据微生物检验的特点，赋予了新的含义定性检验时，采用非参数的统计技术；定量检验时，采用参数的统计技术如仅仅是对传统方法某一环节的替代，则只需对该环节开展验证57 替代方法验证的一般要求由替代方法研发者或方法使用者完成不含样品情况下，替代方法的专属性、精密度和检测限等参数的验证使用至少2个批号的样品，每个样品平行进行3此独立实验，完成各参数的验证在开始各参数验证时，涉及的菌种除包括微生物限度检查法和无菌检查法中培养基适用性检查规定的菌株外，还应根据替代方法及样品的特点增加相应的菌株。各菌种

25、应分别进行验证。58 定性检验方法的验证专属性：是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力检测限：是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量重现性：是指相同的样品在正常的实验条件发生变化时，所得检验结果的精密度。应优先测定该验证参数耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。应优先测定该验证参数。59 定量检验方法的验证在进行结果处理时，应根据微生物定量检验的特点选择合适的数据处理方式，如进行对数转换准确度：是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果一致的程度精密度：是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度，通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示专属性：是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力60定量限：是指样品中能被准确定量测定的微生物最低数量线性：是指在一定范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度范围：是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间重现性：是指相同的样品在正常的实验条件发生变化时，所得检验结果的精密度。耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据61谢 谢