Protein A 、Protein G 与抗体的结合

《Protein A 、Protein G 与抗体的结合》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Protein A 、Protein G 与抗体的结合（5页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、Protein A、Protein G与抗体的结合1 Protein A Sepharose、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合目前，约70-80%的抗体纯化使用Protein A、Protein G亲和层析。蛋白A (Protein A)来源于金黄色葡萄 球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白A作为亲和配基被 偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性， 一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。1个蛋白A分子至少可以结合2个IgG。蛋白A也可以结合另一 些免疫球蛋白，如用于

2、某些种属的IgA、IgM的纯化。天然(Native Protein A)和重组的蛋白A (rProtein A)对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋 白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与IgG 的结合能力。蛋白A与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决 定于结合强度(解离常数)及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间)。2 Protein G Sepharose亲和层析介质与抗体的结合蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，为三型Fc受体。其通过类似于蛋白A的非免疫机制与 抗体的Fc段

3、结合。像蛋白A 一样，蛋白G可以与IgG的Fc区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose可以广泛、更强地结合更多类型的IgG,多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低， 纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白G还可以和某些抗体的Fab和F (ab)段结合。Pro tein G是从G类St rep tococc i细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的IgG Fc段结合(包括： 人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)，分子量：25kDa。ProteinG可用于纯化不能与Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗IgG的纯化。相对于Protein A

4、，Protein G对于大多数哺乳动物的IgG 有着更高的亲和力，尤其是对于IgG的亚基，如人IgG3,小鼠IgG 1和鼠IgG2a。与ProteinA不同,Protein G不与狗IgG结合、不结合人IgM，IgD，或IgA。重组蛋白G(Recomb Protein G)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结 合。因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在 亲和力、稳定性等方面好。本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白G偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶6B上，成为用于抗体分 离纯化的亲和层析介质 本产品稳定性好，基团脱落少，

5、使用寿命长，使用方便，可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体。由于采用了环氧活化的方法，与溴化氰活化方法相比，可获得长短更适合的结合臂，使抗体纯化获得更好 的效果。并且这种方法活化的琼脂糖凝胶没有离子交换的作用，因而其死吸附少。二、亲和介质特性：特点基团脱落少，结合特异性强基质6%的交联琼脂糖凝胶配基重组蛋白G配基密度6mg重组蛋白G/ml吸附载量3-7mg 鼠 IgG2a/ml亲和介质的颗粒大小50T60um最大流速200cm/hpH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11使用温度常温保存温度+48C保存液体20%乙醇三、适用范围Protein A和Protein G的相对结合强度物种物种亚

6、类亚类protein A 结合protein G 结合人lgA可变lgD-lgD-lgG1+lgG2+lgG3-+lgG4+lgM可变鸡蛋黄lgY-牛+狗+山羊-+豚鼠lgG1+lgG2+仓鼠+马+考拉-+骆驼-+猴（恒河）+小鼠lgG1+lgG2a+lgG2b+lgG3+lgM可变猪+兔+大鼠lgGl-+lgG2a-+lgG2b-+lgG3-+绵羊+/-+ =强结合，+ =中等结合，- =弱或不结四、 缓冲液配制建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。A 缓冲液 lmol/L Na2HPO4.12H2O(MW358.14) 358.14g1500 mM NaCl l(MW68.08g/m

7、ol) 87.7g溶于 l 升水，滤膜过滤B 缓冲液 lmol/L NaH2P04 (MW156.01)156.01g1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) 87.7g溶于 l 升水，滤膜过滤C吸附和洗涤缓冲液根据所需PH值，按下表3配制。按照所列比例量取后混合，然后再加9倍体积的水，稀释成应用溶液。如果洗脱下的抗体有些杂带，可加吐温-20 至终浓度0.05%D中和缓冲液:A液77.4ml、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的中和缓冲液E 洗脱液 O.lmol/L NaH2P04 (MW156.01)15.601g150 mM NaCl l(MW68.08g/mol) 8

8、.77g溶于1升水，滤膜过滤，HCl调整PH至3.0五、应用举例A实验名称：从小鼠腹水中分离纯化IgG2a1、 重组蛋白G琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为lml,流尽20%乙醇溶液；2、以缓冲液C平衡5-10个床体积，流速为lml/min；（缓冲液C配制方法：取A液35.2ml、B液64.8ml, 再加 900ml 水，混合后 PH6.5）.3、 将0.2ml小鼠腹水用缓冲液C稀释到2ml，0.45gm滤膜过滤，上样。流速为lml/min；4、用缓冲液C再洗5-10个床体积，流速为lml/min；5、用洗脫液E,洗脫3体积。6、在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液，以PH试纸确认溶液为中性。溶液太酸，会

9、损伤抗体活性（中和缓冲液配制方法：A液77.4ml、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的中和缓冲液7、将分离纯化的IgG2a与对照品同时进行SDS-PAGE电泳分析。8、用纯水流洗10个柱床体积，再用20%的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min,柱子置于+48 C环境中保存表三，25C下O.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制pHA液1mol/L Na HPO (ml)24B液1mol/L NaH PO (ml) 245.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.

10、67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8根据比例量取混合，然后在加9倍体积的水，稀释成应用溶液。B 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）：（1）蛋白样品的准备：1）对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升 细胞裂解液裂解细胞。3）对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。4）对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解 液的用量进行裂

11、解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓 度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。（2）.去除非特异性结合（可选做）：1）.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG 种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4C缓慢摇动30分钟至2小时。2） . 2500rpm（约lOOOg）离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal I

12、gG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和 Protein A+GAgarose 的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。（3）.免疫沉淀：1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4C缓慢摇动过夜。2）.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4C缓慢摇动1-3个小时。（为方便后续的洗涤操作可 以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。）3）. 2500rpm（约1000g）离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉 Protein A+GAgarose。4）.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5 次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离 心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。5）.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀， 瞬时高速离心把样品离心至管底。6）. 100C或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20C保 存。