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1、 课后限时集训37 无菌操作技术实践1(2019哈尔滨三中高三期末)下表是某种微生物培养基的配方表，请据表回答：牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水0.5 g1 g0.5 g2 g200 mL(1)此培养基的营养成分有五类，其中蛋白胨提供的营养物质是_。(2)在培养基制备过程中，各种成分溶化后分装前，必须进行的操作是_。(3)微生物培养最基本的要求是无菌操作，下列对培养基、培养皿、接种环、双手、空气、牛奶所采用的灭菌消毒方法的正确顺序依次是_(填序号)。化学消毒高压蒸汽灭菌干热灭菌紫外灭菌灼烧灭菌巴氏消毒法(4)巴氏消毒法与煮沸消毒法相比，其优点是_。 (5)用稀释涂布平板法统计菌落数目时，最好选择菌落
2、数在_的平板进行计数。若统计出在一稀释倍数为105的平板上的平均菌落数为30，所用稀释液的体积为0.2 mL，则每毫升样品中的细菌数为_个。(6)纯化菌株时，通常使用的划线工具是_。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_。解析(1)微生物培养基的成分包括碳源、氮源、水、无机盐和生长因子。蛋白胨可以为微生物提供碳源、氮源和生长因子。 (2)配制培养基时为保证无菌，各种成分在溶化后分装前必须进行的操作是调节pH，然后再灭菌。(3)培养基常用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，培养皿常用干热灭菌法灭菌，接
3、种环常用灼烧灭菌，双手应用化学药剂消毒，空气可用紫外线杀菌，牛奶常用巴氏消毒法消毒，故对培养基、培养皿、接种环、双手、空气、牛奶所采用的灭菌消毒方法的正确顺序依次是。(4)与煮沸消毒法相比，巴氏消毒法在较低温度下，既可以杀死病菌，又能保持物品中营养物质损失较少和风味不变。(5)使用稀释涂布平板法统计活菌数目时，为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。若统计出在一稀释倍数为105的平板上的平均菌落数为30，所用稀释液的体积为0.2 mL，则每毫升样品中的细菌数为300.21051.5107(个)。(6)纯化菌株时，通常使用的划线工具是接种环。划线的某个平板培养后，第一划线区域
4、的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有：接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始。答案(1)碳源、氮源、生长因子(2)调节pH(3)(4)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少(5)303001.5107(6)接种环接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始2(2019安徽省定远重点中学高三模拟)下表所示为某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题。成分含量蛋白胨10.0 g乳糖5.0 g蔗糖5.0 gK2HPO42.0 g显色剂(伊红美蓝)0.2 g琼脂12.0 g将上述物质溶解
5、后，用蒸馏水定容到1 000 mL(1)根据用途划分，该培养基属于_培养基；若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基做出的最关键的调整是_；若还需鉴定分解尿素的细菌，需做出的调整是_。(2)从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为_。该培养基能否分离筛选出大肠杆菌？为什么？_。(3)在实验室培养微生物时，获得纯净培养物的关键是_，紫外线可对空气进行灭菌的原因是_。(4)某同学尝试纯化大肠杆菌，其中一个平板的菌落分布如图，推测该同学接种时可能的操作失误是_。解析(1)伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，因此该培养基从用途上属于鉴别培养基；若要分离能分解尿素的细菌，则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源，即将蛋
6、白胨换成尿素；若要鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。(2)大肠杆菌需要从培养基中获得碳源，因此其同化作用类型是异养型；由于表格中的培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存，因此该培养基不能分离筛选出大肠杆菌。(3)微生物培养时，关键是防止外来杂菌的感染；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能让蛋白质变性，同时还能破坏DNA的结构。(4)由图乙可知，该同学采用的是稀释涂布平板法，但菌落比较集中，没有分散开来，可能是涂布不均匀导致的。答案(1)鉴别将蛋白胨换成尿素将伊红美蓝换成酚红(2)异养型不能，原因是培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存(3)防止外来杂菌的入侵紫外线能使蛋白
7、质变性，还能破坏DNA的结构(4)涂布不均匀3(2019山西太原高三模拟)实验室有4个人培养的细胞相继污染，污染类型相同，细胞污染后快速变混，大量的团状圆泡状的微生物悬浮，中间透亮。请依据细胞外观形态特征鉴定是细菌污染还是酵母菌污染，并提出预防再次污染的方案。(1)鉴定细菌污染还是酵母菌污染，在显微镜下观察，可根据_进行鉴定；也可以肉眼观察菌落的_等方面来鉴定(至少答出两项)。(2)对于原有的材料、试剂等，应如何处理？_。再一次实验操作中应注意_。制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，操作顺序为：_。(3)除上述外，若家常泡菜制作时，亚硝酸盐含量先变高后变低，含量自然变低的原因是_。根据这个道理，我们人
8、工降低其含量的措施是_。解析(1)细菌为原核细胞，酵母菌为真核细胞，显微镜观察有无成形的细胞核可鉴定二者。也可依据菌落的特征鉴定，即菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等。(2)因为原来的材料、试剂均已污染，因此应放弃所有培养液、胰蛋白酶，为防止造成二次污染，应对这些材料、试剂等灭菌处理。再一次实验操作中应注意实验室灭菌程序要正确。制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作顺序为：计算、称重、溶化、灭菌、倒平板。(3)由于亚硝酸盐具有不稳定、易氧化成硝酸盐等特点，在制作泡菜时亚硝酸盐含量会自然变低。可通过加热等措施降低其含量。答案(1)有无成形的细胞核形状、大小、隆起程度、颜色(至少答两项)(2)将所有培养
9、液，胰蛋白酶等进行灭菌处理并丢弃实验室灭菌程序(高压锅的温度，是否质检过，灭菌周期的持续时间等)正确(或保证无菌操作)计算、称重、溶化、灭菌、倒平板(3)亚硝酸盐不稳定、易氧化成硝酸盐等对腌制液加热等4(2019濮阳市高三二模)英国每日邮报报道，科研人员偶然筛选出一种可以“吃塑料”的细菌(F6菌)，它能够在30 下经过6个星期完全降解PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)薄膜。进一步研究发现，这种细菌以PET作为碳源，其中ISF6酶在降解过程中起着决定性的作用。请回答下列问题：(1)根据报道信息可知，要筛选出F6菌，必须配制以_作为唯一碳源的固体培养基，该选择培养基中应添加_使其呈固态，在培养基各成分
10、溶化后分装前，应进行_和灭菌操作。(2)为保证培养基上能均匀地生长出一层F6菌，首先需要用_法对样液进行梯度稀释，然后取不同稀释度的样品0.1 mL涂布到固体培养基上，将平板_后放入恒温箱培养。PET粉末呈白色，不溶于水，F6菌将PET降解后，高效降解PET的F6菌菌落周围会出现_。若接种24 h后发现某个培养基上没有出现任何菌落，则最可能的原因是_。(3)实验结束后，使用过的培养基应该进行_处理后，才能扔掉。解析(1)固体培养基需加入琼脂等凝固剂，F6菌以PET作为碳源，因此其培养基应以PET为唯一碳源来源。在培养基各成分溶化后分装前，应先调pH再灭菌。(2)为保证培养基上能均匀地生长出单层
11、F6菌菌落，采用稀释涂布平板法对样液进行梯度稀释。为避免皿盖上的水滴落入培养基及皿底上培养基中水分的迅速蒸发，应对平板进行倒置。高效降解PET的F6菌菌落周围会出现直径大的透明圈。若涂布器灼烧灭菌后未经冷却便进行涂布操作，则会导致培养基上不出现任何菌落。(3)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后，才能倒掉。答案(1)PET琼脂调pH(2)稀释涂布平板倒置直径大的透明圈涂布器未冷却(3)灭菌5(2019石嘴山市高三期末)对硝基苯酚(PNP)的颜色为黄色，若其被分解则颜色消失，属于硝基苯酚类有机化合物的一种，主要来源于农药、医药、染料、塑料等生产企业的排放，并广泛分布于环境中，对植物、微生
12、物和动物均有毒性。某生物兴趣小组提出从污水厂曝气池长期驯化的污泥中分离出对硝基苯酚降解菌并研究其降解特性。回答下列问题：(1)分离对硝基苯酚降解菌的选择培养基成分有NH4NO3、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、FeSO4、MgSO47H2O、PNP和琼脂，试从成分分析该选择培养基能起到筛选作用的原因是_。(2)利用_(填接种方法)分离、纯化可得到单一的对硝基苯酚降解菌菌落，可以将在菌落周围是否产生_作为筛选标记。(3)若分离纯化后得到了两个菌落，这两个菌落的形态、大小、光泽度、颜色等_(填“一定”或“不一定”)相同。(4)研究不同的糖类对硝基苯酚降解菌降解PNP的效率的影响，得到的结果如
13、表所示： 加入糖类葡萄糖蔗糖淀粉麦芽糖空白对照降解率99%98%70%95%90%从表中可得出的结论是_。解析(1)对硝基苯酚(PNP)属于硝基苯酚类有机化合物的一种，有机物含碳，同时培养微生物的培养基需要具有碳源、氮源、无机盐和水。故分离对硝基苯酚降解菌的选择培养基成分有NH4NO3、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、FeSO4、MgSO47H2O、PNP和琼脂；该选择培养基能起到筛选作用的原因是PNP作为培养基中唯一的碳源可以将能降解PNP的细菌分离出来。(2)常用的接种微生物的方法有稀释涂布平板法和平板划线法，故利用稀释涂布平板法或平板划线法分离纯化，可得到单一的对硝基苯酚降解菌菌落
14、。对硝基苯酚(PNP)颜色为黄色，若被分解则颜色消失，故可以将在菌落周围产生透明圈作为筛选标记。(3)若分离、纯化后得到了两个菌落，这两个菌落的形态、大小、光泽度、颜色等不一定相同。(4)从表中可看出加入葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的降解率均高于空白对照组的，加入淀粉的降解率低于空白对照组的，故可以得出的结论是除淀粉外，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖均可促进PNP的降解。答案(1)PNP作为培养基中唯一的碳源可以将能降解PNP的细菌分离出来(2)稀释涂布平板法或平板划线法透明圈(3)不一定(4)除淀粉外，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖均可促进PNP的降解6(2019贵阳高三质检)脂肪酶能催化天然植物油脂(甘油三酯)水解，
15、产生脂肪酸和甘油。研究人员欲从某地环境中筛选含低温碱性脂肪酶的菌株，以溴甲酚紫为指示剂(溴甲酚紫随油脂分解紫色变浅)进行系列实验操作。请回答下列问题：(1)自然界中能合成低温碱性脂肪酶的微生物较少，研究人员应在_的环境取土样。(2)若样品中含油脂分解菌很少，应配制_(填“固体”或“液体”)培养基进行选择培养。(3)为了筛选出菌株，可将适量的_指示剂滴加在平板中的菌落周围，洗去浮色一段时间后，如果菌落周围的现象是_，则说明此种菌能够产生脂肪酶。(4)研究人员在分别确定脂肪酶菌株生长的最适碳源浓度和氮源浓度之后，还需进一步实验并确定适合于脂肪酶菌株生长的碳源和氮源浓度的最佳组合。以a和b分别代表碳
16、源和氮源的浓度，假设酶活性a1a2a3；b1b2b3，据此形成下列两种方案，你认为其中较为合理的方案是_， 请说明理由_。方案一：a1和b1，a2和b2、a3和b3分别组合，根据酶活性取其中的最佳组合。方案二：a1分别与每种氮源浓度组合以及b1分别与每种碳源浓度组合，根据酶活性取其中的最佳组合。解析(1)耐低温富含碱性脂肪酶的微生物应生活在低温、盐碱地、含油脂的环境中。(2)液体培养基比固体培养基更适宜微生物的生长，所以若样品中含油脂分解菌很少，应配制液体培养基进行选择培养，可获得大量菌体。(3)根据题干信息，如果在培养基中滴加溴甲酚紫，随着油脂分解，在菌落周围溴甲酚紫将随油脂的分解紫色变浅，
17、说明此种菌能够产生脂肪酶。(4)方案一为两个浓度的简单组合，组合类型太少，组合类型中的酶活性不一定最高；方案二用最佳碳源浓度a1与各氮源浓度组合，选出最佳氮源浓度，再用最佳氮源浓度b1，与各碳源浓度组合，扩大组合范围，进行实验，根据酶活性筛选出最佳碳源和氮源的组合方案。答案(1)低温、盐碱地、被油污染(或含油脂)(2)液体(3)溴甲酚紫菌落周围紫色变浅(4)二方案一为两个浓度的简单组合，酶活性不一定最高；方案二用最佳碳源浓度与各氮源浓度组合，再用最佳氮源浓度，与各碳源浓度组合扩大组合范围，进行实验，根据酶活性筛选出最佳组合方案7(2019梅州市高三检测)凝乳酶是干酪和干酪素生产过程中的关键酶，
18、动植物及微生物均能产生。由于微生物具有资源丰富、生长周期短、受气候等因素限制小等特点，微生物凝乳酶成为研究热点。为获得凝乳酶高产菌株，科研人员进行了以下分离、筛选、鉴定工作。培养基配方表：酪蛋白牛肉膏Na2HPO4NaCl琼脂蒸馏水10 g3 g2 g5 g15 g加至1 000 mL(1)从作用上看，该培养基属于_(填“选择”或“鉴别”)培养基。(2)科研人员将牧区采集的土壤样品放入无菌水中，振荡混匀，制成悬液。为获得较均匀分布的单菌落，还需要将悬液进行_，用_法接种于上述培养基上。接种后的培养基以_状态放入培养箱。(3)在涂布接种前，科研人员随机取若干灭菌后的空白平板先进行培养了一段时间，
19、这样做的目的是_。(4)在稀释倍数为106下涂布了三个平板(每次取0.1 mL)，统计菌落数分别为240、250、260，则稀释前1 mL菌液中所含此菌数量为_个。(5)挑选菌落时以白色沉淀圈大且透明圈小者为佳。将获得的菌株进行液体培养后，从培养液的_(填“上清液”或“沉淀物”)获得粗提的凝乳酶。将一定量的粗提凝乳酶与适量酪蛋白溶液混合，一定时间后测定吸光值来测定酶活性。进行吸光值测定时，需将_与等量酪蛋白溶液混合，作为实验的对照。解析(1)由于实验目的是获得凝乳酶高产菌株，凝乳酶能使乳中酪蛋白凝聚成乳酪，所以培养基中需要加入酪蛋白，从作用上看该培养基属于选择培养基。(2)为获得较均匀分布的单
20、菌落，还需要将悬液进行梯度稀释，并用涂布平板法接种于固体培养基上。为防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养基造成污染，接种后的培养基应以倒置状态放入培养箱。 (3)在涂布接种前，取若干灭菌后的空白平板培养一段时间，其目的是检验培养基平板灭菌是否合格。(4)三个平板菌落的平均数为(240250260)3250，稀释倍数为106，每次取0.1 mL，所以稀释前1 mL菌液中所含细菌数为2500.11062.5109(个)。(5)挑选菌落时凝乳效果较好的为白色沉淀圈大且透明圈小的。将获得的菌株进行液体培养后，从培养液的上清液获得粗提的凝乳酶。将一定量的粗提凝乳酶与适量酪蛋白溶液混合，一定时间后测定吸光值来
21、测定酶活性。进行吸光值测定时，需将等量失活的粗提凝乳酶与等量酪蛋白溶液混合，作为实验的对照。答案(1)选择(2)梯度稀释(稀释)涂布平板倒置(3)检测培养基平板灭菌是否合格(4)2.5109(5)上清液等量失活的粗提凝乳酶8(2019安徽省皖江名校联盟高三摸底)某生物兴趣小组探究不同C/N的值对谷氨酸棒状杆菌数量和产物产生的影响，记录其结果如下表。回答下列问题：分组发酵条件谷氨酸棒状杆菌繁殖速度单个菌体产谷氨酸量第一组通入无菌空气、CN31较慢较多第二组通入无菌空气、CN41较快较少(1)该兴趣小组进行实验时所用培养基除了能为谷氨酸棒状杆菌提供碳源和氮源外，还能提供的主要营养物质是_。(2)统
22、计待测培养液中谷氨酸棒状杆菌的数量，可采用的方法有显微镜直接计数法和稀释涂布平板法。利用显微镜直接计数法统计过程：取第二组的100倍的稀释液0.1 mL滴加到计数板(由2516400个小室组成，容纳液体总体积为0.1 mm3)，在计数室内共有菌体48个，则1 mL的第二组发酵液中有菌体_个。用该方法测定的微生物数量大于实际的活菌数，原因是_。利用稀释涂布平板法统计的结果往往比实际值_(填“偏大”或“偏小”)，原因是_。(3)根据表中信息可知，培养过程中需先将碳氮比设为41，目的是_，然后将发酵液中碳氮比改为31继续培养，目的是_。解析(1)谷氨酸棒状杆菌等微生物的培养基的营养成分包括碳源、氮源
23、、水和无机盐。(2)根据提供的数据进行计算，1 mL的第二组发酵液中菌体数48(0.1103)1004.8107(个)；由于计数的菌体数量包括了死亡的菌体，所以用该方法测定的微生物数量大于实际的活菌数。在利用稀释涂布平板法统计菌体数量时，由于两个或多个细胞连在一起共同形成一个菌落，所以统计的数值比真实值要小。(3)分析表格相关信息可知：C/N值较低时有利于谷氨酸棒状杆菌产生谷氨酸，C/N值较高时有利于谷氨酸棒状杆菌繁殖，因此培养过程中需先将碳氮比设为41，目的是有利于谷氨酸棒状杆菌的繁殖，然后将发酵液中碳氮比改为31继续培养的目的是有利于提高单个菌体产谷氨酸的量。答案(1)水和无机盐(2)4.8107计数的菌体数量包括了死亡的菌体偏小两个或多个细胞连在一起共同形成一个菌落(3)有利于谷氨酸棒状杆菌的繁殖(或有利于增加谷氨酸棒状杆菌的数量)有利于提高单个菌体产谷氨酸的量
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