11核酸的生物学功能5

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1、第第17章章 核酸技术核酸技术 （一）（一）重组重组DNADNA技术技术的的基础基础 （二）（二）重组重组DNADNA技术的基本操作过程技术的基本操作过程 （三）（三）重组重组DNADNA技术的应用技术的应用 （一）重组（一）重组DNADNA技术的基础技术的基础 重组重组DNADNA技术的定义技术的定义 在体外，将一种外源在体外，将一种外源DNADNA和载体和载体DNADNA重新组合重新组合连接，形成杂交连接，形成杂交DNADNA，然后将其转入宿主细胞，最，然后将其转入宿主细胞，最终使外源终使外源DNADNA在宿主细胞中随着宿主细胞的繁殖而在宿主细胞中随着宿主细胞的繁殖而增殖和表达增殖和表达,

2、从而改变生物原有遗传性状的过程，从而改变生物原有遗传性状的过程，称称为为重组重组DNADNA技术技术。它是按生物科学规律，在体外人为的改造基它是按生物科学规律，在体外人为的改造基因，最终往往使生物的遗传性状获得改变，故又因，最终往往使生物的遗传性状获得改变，故又称为称为“遗传工程遗传工程”，亦即，亦即“基因工程基因工程”。1.1.重组重组DNADNA技术的基础技术的基础 (1 1)重要的工具酶重要的工具酶 (2)(2)载体载体 （1 1）重要的工具）重要的工具酶酶 它能够它能够识别识别、切割切割双链双链DNADNA分子中的特定分子中的特定序列，这些特定序列多数为反向重复序列，序列，这些特定序列

3、多数为反向重复序列，一般长度是一般长度是4 4、5 5或或6bp6bp。限制性内切酶限制性内切酶 粘性末端粘性末端 如如 EcoR I:5-GAATTC CTTAAG-3 平齐末端平齐末端 如如 HaeIII:5-GGCC CCGG-3 P GAATTCQPCTTAAGQXGAATTCYXCTTAAGYAATTCQPGPCTTAAGQXGAATTCYXCTTAAGYPCTTAAPGAATTCYGYXCTTAAXGGQAATTCQEcoR1限制性酶酶切限制性酶酶切片段退火与片段退火与DNA连接酶连接连接酶连接 DNA DNA连接连接酶酶 目前使用的连接酶有两种：目前使用的连接酶有两种：大肠杆菌大

4、肠杆菌DNADNA连接酶连接酶 黏性末端连接；黏性末端连接；T T4 4 连接酶连接酶 黏性和平齐末端连接。黏性和平齐末端连接。（2 2）载体）载体 概概 念念 能将外源能将外源DNADNA带入宿主细胞，进行复制扩带入宿主细胞，进行复制扩增或最终使外源基因得以表达的自主增或最终使外源基因得以表达的自主 DNADNA，称为称为载体（载体（vectorvector）。分分 类类 克隆载体克隆载体 用于基因的复制、扩增、用于基因的复制、扩增、测序等；测序等；表达载体表达载体 用于目的基因的表达。用于目的基因的表达。（二）重组（二）重组DNADNA技术的基本操作过程技术的基本操作过程 1.1.目的基因

5、目的基因的获得的获得 2.2.选择和制备载体选择和制备载体 3.3.将目的基因与载体进行切割连接将目的基因与载体进行切割连接 4.4.将重组体导入受体细胞将重组体导入受体细胞 5.5.阳性克隆的筛选和鉴定阳性克隆的筛选和鉴定 6.DNA6.DNA重组体的扩增、表达等研究重组体的扩增、表达等研究 重组重组DNA技术的基本操作过程技术的基本操作过程 1.1.目的基因的获得目的基因的获得 （1 1）提取）提取DNADNA后，后，PCRPCR体外特异扩增体外特异扩增 （2 2）以）以mRNAmRNA为模板，反转录合成为模板，反转录合成cDNAcDNA。（3 3）化学合成基因）化学合成基因 （4 4）限

6、制性内切酶从载体上切取）限制性内切酶从载体上切取 （5 5）构建基因文库，调取目的基因）构建基因文库，调取目的基因 2.2.载体的选择和制备载体的选择和制备 原核生物常用的载体：原核生物常用的载体：质粒和噬菌体；质粒和噬菌体；真核生物常用的载体：真核生物常用的载体：动物病毒、酵母；动物病毒、酵母；穿梭载体：穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞通常是指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。目的基因与载体的酶切与连接目的基因与载体的酶切与连接 3.4.4.重组重组DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞大肠杆菌、酵母、真菌及各大肠杆菌、酵母、真菌及各种真

7、核细胞、受精卵细胞都种真核细胞、受精卵细胞都可用于重组。可用于重组。转化转化 转染转染-5.5.目的基因的筛选和鉴定目的基因的筛选和鉴定 （1 1）遗传学方法）遗传学方法 （2 2）核酸杂交）核酸杂交法法 （3 3）PCRPCR方法方法 （4 4）酶切鉴定）酶切鉴定 （1 1）遗传学方法）遗传学方法 利用载体的特殊标记利用载体的特殊标记 如质粒含有如质粒含有抗青抗青霉素的基因霉素的基因，当，当含外源含外源DNADNA的质粒转化后可的质粒转化后可在含有青霉素的培养基中生长，而未转入在含有青霉素的培养基中生长，而未转入质粒的细菌在同样的条件下不能生长。质粒的细菌在同样的条件下不能生长。（2 2）核

8、酸杂交）核酸杂交法法 菌落原位杂交菌落原位杂交23626 （3）多聚酶链式反应）多聚酶链式反应 20 20世纪世纪8080年代末发展起来的一种年代末发展起来的一种DNADNA特定片段特定片段体外快速合成扩增体外快速合成扩增的方法的方法，称，称多聚酶链式反应多聚酶链式反应（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction，PCRPCR）。）。PCRPCR技技术具有高度的灵敏性和特异性，术具有高度的灵敏性和特异性，能在极短的时能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳，可以直接观察

9、产物的存在，可以直接观察产物的存在。因此，。因此，PCRPCR技术对于鉴定阳性克隆十分有效，而且无需技术对于鉴定阳性克隆十分有效，而且无需制备制备DNADNA。（4 4）酶切鉴定酶切鉴定目目的的基基因因表表达达 6.（三）重组（三）重组DNADNA技术的应用技术的应用 1.1.DNADNA指纹技术指纹技术 2.2.转基因动物与动物克隆转基因动物与动物克隆 3 3.基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 1.DNA 1.DNA指纹技术指纹技术 DNADNA指纹指纹(DNA fingerprint)(DNA fingerprint)技术是技术是20 20 世纪世纪7070年代末发展起来的遗传标记的方

10、法。年代末发展起来的遗传标记的方法。遗传标记遗传标记（genetic markergenetic marker）是指是指可用可用来区分不同群体或个体，又能稳定遗传的来区分不同群体或个体，又能稳定遗传的某些物质某些物质。生物个体间的差异在本质上是生物个体间的差异在本质上是 DNADNA的差的差异，因此异，因此DNADNA是最可靠的遗传标记是最可靠的遗传标记。（1 1）限制性片段长度多态性）限制性片段长度多态性 真核生物的真核生物的DNADNA分子很长，在遗分子很长，在遗传过程中传过程中DNADNA碱基由于碱基由于替换、重排、替换、重排、插入、缺失等插入、缺失等原因，在子代原因，在子代DNADNA

11、中中会引起差异形成多态性。会引起差异形成多态性。当用当用一种限制性内切酶去切一种限制性内切酶去切DNADNA时，时，DNADNA分子会降解成许多长短不分子会降解成许多长短不等的片段，个体间这些片段是特异等的片段，个体间这些片段是特异的，可以作为某一的，可以作为某一DNADNA（生物）的（生物）的标记标记，将这种方法称为，将这种方法称为限制性片段限制性片段长度多态性（长度多态性（restriction restriction fragment length polymorphismfragment length polymorphism，RFLPRFLP）。F1人的指纹分析示意图F1人的指纹分析

12、示意图个体个体 1个体个体 2 在人体在人体DNADNA文库中发现的由文库中发现的由970bp970bp重复单位串重复单位串联重复排列而成的高变异区联重复排列而成的高变异区，称为，称为小卫星小卫星DNADNA（minisatelliteminisatellite DNA DNA）。不同个体的多态性来源。不同个体的多态性来源于重复单位的重复次数不同，于重复单位的重复次数不同，同一家族小卫星重同一家族小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列，用某一小卫复单位含有相同或相似的核心序列，用某一小卫星星DNADNA作探针，可与同一或不同物种多酶切作探针，可与同一或不同物种多酶切DNADNA片片段杂交，获得

13、段杂交，获得DNADNA指纹图谱（指纹图谱（DNA fingerprintDNA fingerprint）。所有真核生物基因组中还存在由所有真核生物基因组中还存在由2-6bp2-6bp为重复单为重复单位的重复顺序位的重复顺序，因其重复单位比小卫星短，称为，因其重复单位比小卫星短，称为微卫星微卫星DNADNA（microsatellitemicrosatellite DNA DNA）。）。真核生物的小卫星真核生物的小卫星DNA DNA 人的人的DNA 指纹图谱指纹图谱 F1人的指纹分析示意图 （2 2）随机扩增多）随机扩增多态性态性DNADNA 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA DNA（Ran

14、domly Amplified Randomly Amplified polymorphic DNA polymorphic DNA，RAPDRAPD），又称又称随机引物随机引物PCRPCR。是。是以以910910 个核苷酸的随机序列作引物，个核苷酸的随机序列作引物，以基因组以基因组DNADNA为模板进行为模板进行PCRPCR 扩增。产物电泳后紫外观察，扩增。产物电泳后紫外观察，不同个体的图带差异明显，不同个体的图带差异明显，如如DNADNA指纹图谱指纹图谱一样一样。F1人的指纹分析示意图F1人的指纹分析示意图个体个体 1个体个体 2 2.2.转基因动物与动物转基因动物与动物克隆克隆 （1 1

15、）转基因动物转基因动物 （2 2）体细胞克隆体细胞克隆无性繁殖无性繁殖 1982 年，人们年，人们将将大白鼠的生长激素大白鼠的生长激素基因基因放在质粒中小放在质粒中小白鼠金属巯基蛋白白鼠金属巯基蛋白启动子之后启动子之后。将重组好的这种将重组好的这种质粒，用特制的微质粒，用特制的微量注射器注入小鼠量注射器注入小鼠受精卵的雄性原细受精卵的雄性原细胞核中，再将这个胞核中，再将这个受精卵植入小鼠子受精卵植入小鼠子宫宫中。中。（1）转基因动物）转基因动物启动子启动子 结果结果为发育成为发育成熟的小鼠体重比熟的小鼠体重比对照小鼠大两倍，对照小鼠大两倍，成为成为“硕鼠硕鼠”或或“超级鼠超级鼠”。1986 年

16、，美国制备年，美国制备出出转生长激素基因转生长激素基因的的猪猪。这种猪生长快，。这种猪生长快，饲料转换率和瘦肉率饲料转换率和瘦肉率显著提高而肥膘低，显著提高而肥膘低，与注射生长激素的效与注射生长激素的效果相同。果相同。我国现制备出转基我国现制备出转基因猪、羊、兔等。因猪、羊、兔等。然而，然而，转生长激素基转生长激素基因的猪因的猪生殖能力明显生殖能力明显下降，不能繁殖扩群。下降，不能繁殖扩群。1996 年年 7 月世月世 界第一例从界第一例从成年成年 动物体细胞动物体细胞，克，克 隆出的哺乳动物隆出的哺乳动物 绵羊绵羊“多利多利”诞生。诞生。1997年年2月月 Nature杂志报道杂志报道 将这

17、个秘密向世人将这个秘密向世人 公布。公布。（2 2）体细胞克隆）体细胞克隆无性繁殖无性繁殖 克克 隆隆 羊羊 多多 利利 的的 产产 生生 过过 程程 多利羊之父多利羊之父 威尔穆特教授威尔穆特教授 英国爱丁堡英国爱丁堡 罗斯林研究所，罗斯林研究所，苏格兰胚胎学苏格兰胚胎学 家。家。1998年年 克隆批量化克隆批量化 美国美国克隆出克隆出5050多只老鼠。多只老鼠。日本日本克隆出克隆出8 8只完全一样的小只完全一样的小牛。牛。美国俄美国俄 勒冈州勒冈州 沃尔小沃尔小 组成功组成功 克隆两克隆两 只只恒河恒河 猴猴。20002000年年人类的近亲被克隆人类的近亲被克隆 克隆猪克隆猪 同年，帮助培

18、育出多利羊的生同年，帮助培育出多利羊的生物技术公司克隆出物技术公司克隆出5 5只小猪仔，并宣称克隆只小猪仔，并宣称克隆猪终将成为人类移植器官的猪终将成为人类移植器官的“加工厂加工厂”，生产器官包括角膜、皮肤、肾、肝生产器官包括角膜、皮肤、肾、肝 、肺、肺、心脏等。心脏等。珍稀濒危动物的繁殖珍稀濒危动物的繁殖 克隆克隆大熊猫大熊猫的实的实验验已开始报道已开始报道。20012001年年至今关于克隆至今关于克隆人人 关于克隆人的问题争论的很激烈，在理关于克隆人的问题争论的很激烈，在理论上，利用同样方法，人可以克隆人，但论上，利用同样方法，人可以克隆人，但各国至今还不允许克隆人。各国至今还不允许克隆人

19、。20012001年，美、意科学家联手展开年，美、意科学家联手展开克隆人克隆人体胚胎体胚胎的工作。的工作。1111月，美国科学家宣布首月，美国科学家宣布首 次克隆成功了处于早期阶段的人类胚胎，次克隆成功了处于早期阶段的人类胚胎，称其称其目标目标是为病人是为病人“定制定制”出不会诱发排出不会诱发排异异 反应的人体细胞用于移植。反应的人体细胞用于移植。20042004年年8 8月月1111日英国颁发全球首张日英国颁发全球首张“克隆克隆人类胚胎人类胚胎”执照执照，合法执照有效期为一年，合法执照有效期为一年，胚胚胎胎1414天后必须毁坏，培育克隆婴儿仍属非法天后必须毁坏，培育克隆婴儿仍属非法行为。行为

20、。研究目的研究目的 增加人类对自身胚胎发育增加人类对自身胚胎发育的理解；的理解；增加人类对高危疾病的认识和高增加人类对高危疾病的认识和高危疾病治疗方法的研究。危疾病治疗方法的研究。克隆动物存在的问题克隆动物存在的问题 克隆动物健康问题克隆动物健康问题很多，很多，世界各地的世界各地的克隆动物流产克隆动物流产、夭折、畸形现象非常严重夭折、畸形现象非常严重。尽管现在关于克隆的争尽管现在关于克隆的争论很多，但论很多，但有一点是肯定有一点是肯定的，那就是克隆技术远不的，那就是克隆技术远不成熟，应用克隆技术时需成熟，应用克隆技术时需格外慎重。格外慎重。多利虽顺利怀孕生子，多利虽顺利怀孕生子，但寿命短，但寿

21、命短，2003年月年月 2 月月 15 日，仅岁半的多利羊日，仅岁半的多利羊死亡。死亡。3.3.基因治疗基因治疗 是指在是指在特定靶细特定靶细 胞的基因组中，插胞的基因组中，插 入外源基因或用外入外源基因或用外 源基因置换异常基源基因置换异常基 因因，使细胞表达本使细胞表达本 来该基因不表达的来该基因不表达的 产物，籍以补偿或产物，籍以补偿或 抑制异常表达的基抑制异常表达的基 因，达到治疗疾病因，达到治疗疾病 目的目的，称为，称为基因治基因治 疗（疗（genetherapygenetherapy）。思考题思考题 1.1.简述简述DNADNA重组技术的基本过程？重组技术的基本过程？2.2.基因工程载体包括哪些种类？基因工程载体包括哪些种类？3.3.获得目的基因的方法有哪些？获得目的基因的方法有哪些？4.4.试述核酸鉴定与试述核酸鉴定与DNADNA重组技术的实际应用。重组技术的实际应用。