项目一显微镜的使用及霉菌形态观察
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1、项目一 显微镜的使用及霉菌形态观察一、实训目的学习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术,了解油镜的基本原理;掌握霉菌形态观察的基本方法,学习涂片的制作,了解霉菌的基本形态。二、实训原理(一)油镜镜头的辨认油镜头上常刻有OI(oil immersion)或HI(homogeneneous immersion)字样,有的还刻有一圈红线或黑线标记,在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中,油镜的放大倍数和数值孔径(numerical aperture)最大,而工作距离最短(图1-1)图1-1 显微镜物镜参数示意图(二)显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数,更重要的是看它分辩率的大小。分辨率是指显
2、微镜能分辨出物体两点间最小距离(D)的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长()成正比,与物镜的数值孔径(NA)成反比。从上式可看出,缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角,)的一半正弦与介质折射率(n)的乘积; 影响数值孔径大小的因素,一是镜口角,二是介质的折射率。当镜与装片之间的介质为空气时,由于空气(n= 1.52)的折射率不同,光线会发生折射,不仅使进入物镜的光线减少,降低了视野的照明度,而且会减少镜口角(图1-2A)。当以香柏油(n=1.515)为介质时,由于它的折射率与玻璃相近,光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生
3、折射(图1-2B),不仅增加了视野的照明度,更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55m。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时,它能辨别两点之间的距离为0.42m;而使用数值孔径为1.25的油镜时,能辨别两点之间的距离则为0.22m。图1-2 介质为空气(A)与介质为香柏油(B)时光线通过的比较三、实训用品与材料木霉(Trichoderma)、 显微镜、接种针、接种环、无菌水、擦镜纸、载玻片、盖玻片。四、实训操作步骤(一)制片1准备载波片 载玻片应洁净、无油污,否则应先擦干净。方法是先用左手食指和拇指捏住载波片两端,滴上23滴95%酒精,用洁净的双层纱布反复捻转擦
4、干净,然后在酒精灯火焰上烘烤几次,烘烤面向上放于实训台上。 2涂片 在超净工作台,把接种针在酒精灯上灼烧,冷却后在平皿中挑取少许木霉菌丝,涂在载玻片上,用接种环在载玻片上滴一滴无菌水、直径约1cm。后将用接种针把菌丝平铺,盖好盖玻片。 (二)镜检1.将显微镜置于平稳的实训台上,镜座距实训台边沿约为4cm,坐正,练习用左眼观察。2调节光源:将低倍物镜转到工作位置,把光圈完全打开,聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源,光线较强的天然光源宜用平面镜,光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜,对光至视野内均匀明亮为止(观察染色装片时,光线宜强;观察末染色装片时,光线不宜太强)。3.低倍
5、镜观察首先上升镜简,将做好的涂片置于载物台上,用标本夹夹住,将观察位置移至物镜正下方,物镜降至距装片0.5cm处,适当缩小光圈然后两眼从目镜观察,转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时,改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片,把合适的观察部位移至视野中心。4.高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察,旋转转换器,将高倍镜转至正下方,注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察,仔细调节光圈,使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。重点观察菌丝是否分隔,木霉的分生孢子形状特点,分生孢子梗性状等。 (三)镜检完毕后工作1移开物镜镜头。2取出装片。3擦净显微镜,将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下,不可使其正对聚光器,同时降下聚光器,转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩,对号放入镜箱中,置阴凉干燥处存放。五、思考与作业1. 分别绘出木霉菌的菌丝、分生孢子、分生孢子梗的形态,并注明物镜与目镜的放大倍数。2使用光学显微镜特别注意哪些问题?3当物镜从低倍镜转到高倍镜时,对照明度有何要求?应如何调节?
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