菌种培养技术

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1、如何选育菌种?为了获得适合大规模工业生产所需的优良生产菌种，一般首先是从自然界分离筛选具有产生目标产 物能力的菌种，但这样获得的菌种的生产能力往往较低，生理生化特性不一定能满足生产要求，还需要进 行大量的诱变选育，进一步提高其生产能力，改善性能；也可以对现有的生产菌种进行改造，即经诱变育 种，选育出符合实际生产需要的菌株。自然界中微生物资源异常丰富，土壤、水、空气、腐败的动植物残骸，都是微生物的主要集居和生 长繁衍的场所。其种类之多，至今仍然是一个难于估测的未知数。以其集居环境（包括特殊和极端环境）、 营养类型、生存方式、生理类型、代谢途径、合成能力等比较，均居生物界之冠。因此，微生物资源的开

2、 发和应用是当今世界瞩目的重大课题。菌种的分离，不仅是把混杂的各类微生物有效地分开，得到纯种，更重要的是依着生产实际的要求， 有的放矢、快速、准确地将能产生所需产物，或具有某种生化反应性能的菌种，从大量的微生物中挑选出 来。有时是设计一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法，更多的是利用特定的方法分离，获得所需菌种 后，再进行识别。为了使获得的菌种能满足工业生产的需要，须考虑各种性能指标。因此，菌种分离和筛 选的方法和策略就十分重要。一般的菌种分离纯化和筛选步骤可分为采样、增殖与分离、发酵与性能测定等几个步骤。步骤和方 法如下图所示：r文献充和策略研究+准锦工花-一瓠究方案设计jL建立快捷度储的凰

3、定方法建立第选襟型）采染际本（以生态利环境为嵌据）厂席集培弈【以投业所好、取其所抗为原则J +ir。第一祝平板分离原种料面q站换胳罪-i-第二次常集培养一ItL第二次乎板分席-原种斜面i厂平极成播瓶发酵初怖ci株1乾）博种初端-+-第三次平板分陶-原种斜而-ir 菌株摇瓶发酵其筛（1株3-5瓶）函种夏筛一 -第四次平振分湖-螟排斜面-街种郡总发醉披带（株3书瓶）-I较就谓神斜面（IT栋）-两壁育种出发茵腺j雅性园验性能蟹定-生产性能考腌IL宛律匕艺条件南冉保藏3. 发酵培养基如何配制？首先需了解微生物需要的营养物质。（1）微生物需要的营养物质营养物质应满足微生物的生长、繁殖和完成各种生理活动的

4、需要。它们的作用可概括为形成结构（参 与细胞组成）、提供能量和调节作用（构成酶的活性和物质运输系统）。微生物的营养物质有六大类要素，即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源。 水水是微生物的重要组成部分，在代谢中占有重要地位。水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离 水。结合水与溶质或其他分子结合在一起，很难加以利用。游离水（或称为非结合水）则可以被微生物利 用。 碳源碳在细胞的干物质中约占50%，所以微生物对碳的需求最大。凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中 碳架来源的营养物质，称为碳源。作为微生物营养的碳源物质种类很多，从简单的无机物(CO2、碳酸盐)到复杂的有机含碳化合物(糖、 糖的衍生物、

5、脂类、醇类、有机酸、芳香化合物及各种含碳化合物等)。但不同微生物利用碳源的能力不 同，假单孢菌属可利用90种以上的碳源，甲烷氧化菌仅利用两种有机物：甲烷和甲醇，某些纤维素分解菌 只能利用纤维素。大多数微生物是异养型，以有机化合物为碳源。能够利用的碳源种类很多，其中糖类是最好的碳源。异养微生物将碳源在体内经一系列复杂的化学反应，最终用于构成细胞物质，或为机体提供生理活 动所需的能量。所以，碳源往往也是能源物质。自养菌以CO2、碳酸盐为唯一或主要的碳源。CO2是被彻底氧化的物质，其转化成细胞成分是一个还原 过程。因此，这类微生物同时需要从光或其他无机物氧化获得能量。这类微生物的碳源和能源分别属于不

6、 同物质。 氮源凡是构成微生物细胞的物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质，称为氮源。细胞干物质中氮的含 量仅次于碳和氧。氮是组成核酸和蛋白质的重要元素，氮对微生物的生长发育有着重要作用。从分子态的 N2到复杂的含氮化合物都能够被不同微生物所利用，而不同类型的微生物能够利用的氮源差异较大。固氮微生物能利用分子态N2合成自己需要的氨基酸和蛋白质，也能利用无机氮和有机氮化物，但在 这种情况下，它们便失去了固氮能力。此外，有些光合细菌、蓝藻和真菌也有固氮作用。许多腐生细菌和动植物的病原菌不能固氮，一般利用铵盐或其他含氮盐作氮源。硝酸盐必须先还原 为NH+4后，才能用于生物合成。以无机氮化物为唯一氮源的

7、微生物都能利用铵盐，但它们并不都能利用硝 酸盐。有机氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆等，工业上能够用黄豆饼粉、花生饼粉和鱼粉等作为 氮源。有机氮源中的氮往往是蛋白质或其降解产物。氮源一般只提供合成细胞质和细胞中其他结构的原料，不作为能源。只有少数细菌，如硝化细菌利 用铵盐、硝酸盐作氮源和能源。 无机盐无机盐也是微生物生长所不可缺少的营养物质。其主要功能是：构成细胞的组成成分；作为 酶的组成成分；维持酶的活性；调节细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位；作为某些自氧 菌的能源。磷、硫、钾、钠、钙、镁等盐参与细胞结构组成，并与能量转移、细胞透性调节功能有关。微生物 对它们的需求量较大(10-4

8、10-3mol/L)，称为“宏量元素”。没有它们，微生物就无法生长。铁、锰、 铜、钻、锌、钼等盐一般是酶的辅因子，需求量不大(10-810-6mol/L)，所以，称为“微量元素”。不 同微生物对以上各种元素的需求量各不相同。铁元素介于宏量和微量元素之间。在配制培养基时，可通过添加有关化学试剂来补充宏量元素，其中首选是K2HPO4和MgSO4，它们可提 供需要量很大的元素：K、P、S和Mg。微量元素在一些化学试剂、天然水和天然培养基组分中都以杂质等 状态存在，在玻璃器皿等实验用品上也有少量存在，所以，不必另行加入。 生长因子一些异养型微生物在一般碳源、氮源和无机盐的培养基中培养不能生长或生长较差

9、。当在培养基中 加入某些组织（或细胞）提取液时，这些微生物就生长良好，说明这些组织或细胞中含有这些微生物生长 所必须的营养因子，这些因子称为生长因子。生长因子可定义为：某些微生物本身不能从普通的碳源、氮源合成，需要额外少量加入才能满足需 要的有机物质，包括氨基酸、维生素、嘌吟、嘧啶及其衍生物，有时也包括一些脂肪酸及其他膜成分。各种微生物所需的生长因子不同，有的需要多种，有的仅需要一种，有的则不需要。一种微生物所 需的生长因子也会随培养条件的变化而变化，如在培养基中是否有前体物质、通气条件、pH和温度等条件， 都会影响微生物对生长因子的需求。从自然界直接分离的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的

10、菌株，均称为该微生物的野生型。绝 大多数野生型菌株只需简单的碳源和氮源等就能生长，不需要添加生长因子；经人工诱变后，常会丧失合 成某种营养物质的能力，在这些菌株生长的培养基中，必须添加某种氨基酸、嘌吟、嘧啶或维生素等生长 因子。 能源能源是指为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。微生物的能源谱如下：有机物：化能异养型微牛物的能源化学物质与碳源粕同）I无机物：化能自养瑁谶生物的能醇不同于碳源】谱辐射能光能自羿和光能异养型微生物的能源化能异养型微生物的能源即碳源；化能自养型微生物的能源都是还原态的无机物，如叫、叫-、S、 晔、史、Fez,等，它们分别属于硝化细菌、亚硝酸细菌、硫化细菌

11、、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。一种营养物常有一种以上营养要素的功能，即除单功能营养物外，还有双功能，甚至三功能营养物。 辐射能是单功能；还原态无机养分常是双功能的（NH4+既是硝化细菌的能源，又是它的氮源）甚至是三功 能的（能源、氮源和碳源）；有机物常有双功能或三功能作用。（2）配制培养基必须遵循的原则微生物的培养基通常指人工配制的适合微生物生长繁殖，或积累代谢产物的营养基质。广义上说， 凡是支持微生物生长繁殖的介质或材料，均可作为微生物的培养基。一个适当的培养基配方，对发酵产品 的产量和质量有着极大的影响。针对不同微生物，不同的营养要求，可以有不同的培养基。但它们的配制必须遵循一定原则。 营养

12、物质应满足微生物的需要。不同营养类型的微生物对营养的需求差异很大，应根据菌种对各 营养要素的不同要求进行配制。 营养物的浓度及配比应恰当。营养物浓度太低，不能满足微生物生长的需要；浓度太高，又会抑 制微生物生长。糖和盐浓度高有抑菌作用。碳氮比（C : N,以还原糖含量与粗蛋白含量的比值表示）：一般培养基为C：N=100：0.52。在设计培养基配比时，还应考虑避免培养基中各成分之间的相互作用，如蛋白胨、酵母膏中含有磷 酸盐时，会与培养基中钙或镁离子在加热时发生沉淀作用；在高温下，还原糖也会与蛋白质或氨基酸相互 作用而产生褐色物质。 物理、化学条件适宜。pH:各种微生物均有其生长繁殖的最适pH，细

13、菌为7.08.0，放线菌为 7.58.5，酵母为3.86.0，霉菌为4.05.8。对于具体的微生物菌种，都有各自的特定的最适pH范围， 有时会大大突破上述界限。在微生物生长繁殖过程中，会产生能够引起培养基的pH改变的代谢产物，尤其 是不少微生物有很强的产酸能力，如不适当地加以调节，就会抑制甚至于杀死其自身。在设计培养基时， 要考虑培养基的pH调节能力。一般应加入缓冲液或CaCO3,使培养基的pH稳定。其他：培养基的其他理化指标，如水活度、渗透压也会影响微生物的培养。在配制培养基时，通常 不必测定这些指标，因为培养基中各种成分及其浓度等指标的优化，已间接地确定了培养基的水活度和渗 透压。此外，各

14、种微生物培养基的氧化还原电位等也有不同的要求。 培养目的：培养基的成分直接影响培养目标。在设计培养基时，必须考虑是要培养菌体，还是要 积累菌体代谢产物；是实验室培养，还是大规模发酵等问题。用于培养菌体的种子培养基营养成分应丰富，氮源含量宜高，即碳氮比值应低；相反，用于大量积 累代谢产物的发酵培养基，氮源应比种子培养基稍低；当然，若目的产物是含氮化合物时，有时还应该提 高培养基的氮源含量。在设计培养基时，还应该特别考虑到代谢产物是初级代谢产物，还是次级代谢产物。如果是次级代 谢产物，还要考虑是否需加入特殊元素（如维生素B12中Co）或特殊的前体物质（如生产青霉素G时，应 加入苯乙酸）。在设计培养

15、基，尤其是大规模发酵生产用的培养基时，还应该重视培养基组分的来源和价 格，应该优先选择来源广、价格低廉的培养基。（3）几种培养基的配制原则 种子培养基：适用于微生物菌体生长的培养基，目的是为下一步发酵提供数量较多，强壮而整齐 的种子细胞。一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。 发酵培养基：用于生产预定发酵产物的培养基，一般的发酵产物以碳源为主要元素。发酵培养基 中的碳源含量往往高于种子培养基。如果产物的含氮量高，应增加氮源。在大规模生产时，原料应该价廉 易得，还应有利于下游的分离提取工作。 繁殖和保藏培养基：主要用于菌种保藏，大部分是斜面培养基。对营养缺陷型或结构类似物抗性 菌株或抗生素抗性菌株

16、来说，可适当加入特定的对应成分，提供压力。 基本培养基：又称最低限度培养基，指能够满足某菌种的野生型菌株最低营养要求的合成培养基。 不同微生物的基本培养基很不相同，有的极为简单（大肠杆菌），有的极为复杂（乳酸菌、酵母或梭菌）， 需加生长因子和特殊营养。 加富培养基：是在普通培养基中加入血、血清、动（植）物组织液或其他营养物（如生长因子） 的一类营养丰富的培养基。主要用于某种或某类营养要求苛刻的异氧型微生物，或者用来选择性培养（分 离、富集）某种微生物。具有助长某种微生物的生长，抑制其他微生物生长的功能。广义上讲，保藏和鉴 别培养基也属于加富培养基。 选择性培养基：根据某种或某类微生物的特殊营养

17、要求，或对某些物理、化学条件的抗性而设计 的培养基。目的是利用这种培养基把某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。一是根据某些微 生物对碳源、氮源的需求而设计，二是根据某些微生物的物理和化学抗性而设计。如嗜酸、嗜碱、嗜盐、 抗性微生物富集等。4. 味精是怎样生产出来的？味精发酵生产工艺流程如下图:原料（淀粉）顼/理（水解）斜面种子配料 擂瓶种子 空/净化系统1 I j种子培菲基种子携分过醐器与I 4发酵培舞基发酵瑞一分过沌器I砒素虻嫌等Hi点诅漩粗%射;酸中和t脱散+袱缩t结晶+成品昧薜我国工业生产味精使用的菌种主要是经过诱变育种得到的营养缺陷型的北京谷氨酸棒状杆菌，它不 能直接利用淀粉

18、或活糊精，需预先将它们水解成葡萄糖，或使用糖蜜等作为碳源。生物素是谷氨酸生产菌 必需的生长因子。培养基中必须提供生物素，否则菌体难以生长。但是过多的生物素对谷氨酸的合成和分 泌又带来不利影响。培养基中的氮源含量较高，一般可以使用硫酸铵、氨水、尿素和液氨为氮源。但是， 由于谷氨酸产生菌的生长和合成时期pH需要维持在7.0到7.2，而且培养基中的铵离子浓度又不宜太高， 因此多采用连续流加的方法。由于产谷氨酸的菌种能够将尿素分解而提供铵离子，因此目前国内多采用批 式流加尿素的方法。发酵罐的培养基装量比为0.7，接种量为0.5%1%，发酵的前期温度为3335 C，中后期为36 38 C，通气比为1：0

19、.110.13（V/V），发酵12 h后开始流加尿素。维持发酵液pH在7.0以上，pH下降 后再次流加尿素，需要流加35次。发酵结束后用盐酸将发酵液pH调到4.04.5,初结晶，2 h后再将pH调到3.03.2，降温结晶， 虹吸除去上层菌体，下层经离心处理的粗谷氨酸，收率可达到80%。然后精制，将粗谷氨酸溶于适量水， 用活性炭脱色，加入碳酸钠，中和成盐，再进一步精制得到谷氨酸成品。5. 啤酒是怎样生产出来的？啤酒生产的工艺过程如下：大麦，浸渍+发芽+烘干* v水载沸糖化谷物f大米、玉米、如粉、V大麦呐）暧槽一罕酒花，蜜沸过姬一A厮酒花酵母渡液发帮会离废醉母装艘巴氏灭精成品啤酒大麦加水后于131

20、5 C浸渍4080 h,放到发芽床上堆放24 h,进行发芽。之后摊开，调节温度， 维持1525 C,发芽周期为10天以上，生成a和月-淀粉酶，使麦芽淀粉水解溶解，同时生成蛋白酶、 核糖核酸酶、磷酸酯酶、P -葡聚糖酶等，使麦芽汁具有酵母发酵所需的养分。含氮高的麦芽不宜制作啤酒麦芽，一般含氮低于1.5%1.8%的麦芽才可使用。制成的绿麦芽含水约 45%，需在干燥塔内通热风烘干，在4548 C下使水分降到10%，然后升温到100 C或更高使水分降到5%， 经摩擦除去幼根，干燥后的绿麦芽失去酶活性30%60%，并不再生成酶。麦芽内的氨基酸或类似化合物与 糖类反应生成麦芽特有的色、香、味。麦芽经辊筒轧

21、碎，加天然或经处理的富含钙和镁盐的热水24份，进行糖化，糖化温度须严格控制， 上面啤酒用浸出法，糖化温度为6368 C；下面啤酒用煮出法，醪液温度达到45 C，取出一部分在糊化 锅煮沸后返回糖化锅与主醪混合，这一步须反复进行至麦芽温度达到7075 C为止。糖化醪料的50%由不 发芽的谷物，如大米、玉米、面粉、大麦粒或大麦粉、大麦片组成，有时在与主醪混合前需糊化。这些不 发芽辅料可改进最终产品的质量，如啤酒的泡沫稳定性和在储藏期间保持澄清、不走味。糖化后在转化锅或过滤槽中使麦芽汁与废糟分离。麦芽汁含碳水化合物约10%，含氮量约为0.08%， 氮在发酵过程和提高啤酒最终质量上都有重要意义。滤清的麦

22、芽汁加酒花煮沸2.5 h以上，酒花用量因啤酒而异，每100 L用200700 g，酒花含有芳 香树脂，赋予啤酒苦味和啤酒香味。用过的酒花通过过滤分离除去。经灭菌冷却，去除冷凝固物的糖化混 合醪液移入敞口或密闭的发酵容器，接种酵母，上面啤酒采用啤酒酵母接种，这种酵母倾向于浮于表面。 发酵温度为1520 C，需16天（根据工艺而定）。发酵衰退后放出新啤酒，从液面刮去酵母，或用离 心机回收。下面啤酒用卡尔斯伯酵母接种，这种酵母倾向于下沉液底。发酵温度68 C，需1012天， 在0 C下陈酿数星期至几个月，因此，也称为陈酿啤酒。虽然麦芽特有的香与味大部分在煮沸时挥发了，但麦芽的各种成分会影响发酵副产品

23、的生成，产生 微妙的啤酒风味。啤酒包装分桶装和瓶装，瓶装啤酒需经冷冻、过滤、二氧化碳饱和，装瓶后需再经巴氏 法灭菌。6. 发酵工业的大致历程是怎样的?发酵工业大致经历了以下几个时期。（1）原始发展时期：人类有意无意地利用微生物已经有几千年的历史，在长期的生产实践中，积累 了丰富经验。最初可能是人类发现储存水果会自然发酵变酒，而逐渐形成酿酒技术。相传，在埃及和中亚 两河流域，在公元前40世纪至公元前30世纪已开始酿酒。我国利用微生物进行谷物酒类发酵，至少是在 四千年前的龙山文化时期，因为考古发现，这时已经有了酒器。在夏禹时期已有了关于仪侠酿旨酒，夏少 康（即杜康）造秫酒的记载。随着社会的发展，又

24、出现制酱和酱油、醋、泡菜、奶酒、干酪技术和面团发 酵。这个时期，发酵技术原始，顶多是家庭小制作，技术是以师徒传承方式进行，技术进步缓慢，完全 是经验式的。在几千年的文明史中，人们只知道这样做可以得到所需的东西，并不知道其中的原理。（2）传统发酵时期：1680年荷兰人列文虎克制成显微镜，人们才知道在我们这个世界上还存在被忽 略了的微生物。1867年法国生物学家巴斯德通过实验证明了酒精发酵是由活的酵母引起的，而其他不同的 发酵产物则是由不同微生物产生。1897年德国的毕希纳进一步发现，即使将酵母磨碎，仍然能使糖发酵形 成酒精，他将这种具有发酵能力的物质称为酶。从而人们才开始了解发酵现象的本质。从1

25、9世纪末到20世纪30年代，随着人们对微生物世界认识的不断深入和发展，利用微生物生产的 新产品不断出现，例如，酒精、乳酸、面包酵母、丙酮、丁醇、柠檬酸、淀粉酶和蛋白酶等。这些产品的 生产使用的微生物大部分是厌氧或兼性厌氧菌，有的采用与酒类生产相似的固体培养基发酵，有的采用液 体厌氧发酵，产品都是化学结构比原料更简单的产物。采用开放式的发酵方式，生产过程较为简单，对生 产设备要求不高，规模一般不大，因此被称为传统发酵工业。（3）现代发酵工业时期：1928年，弗莱明发现青霉素能杀菌，1929年6月，他将自己的发现写成 论文发表。由于青霉素具有抑制细菌的能力，对动物无害，弗莱明建议用这种青霉菌培养液

26、作局部外敷，来治 疗溃疡一类的皮肤感染。但是，因为青霉素在培养物中的含量太少，没有办法大量制备供给使用。还由于 当时人们正热衷于研究磺胺药物，把希望寄托在正在风靡的磺胺药物上。更重要的是：1932年，克鲁德布 科（Clutterbuck）和1935年瑞德（Reid）根据弗莱明的发现，对青霉菌的培养物也进行了研究，并提取 了青霉素，他们发现在水溶液里青霉素性质不稳定，认为不适合用作抗感染性疾病的药物，也不值得深入 地进行化学与生物学的研究。因此，人们就这样把青霉素放弃了。人类20世纪的上半叶多灾多难，战争频发，疾病流行，因为无药救治造成大量死亡。1939年第二次 世界大战爆发，大量伤员因为感染无

27、法控制而在痛苦的煎熬中死去，急需大量的抗感染药物。于是人们又 想到既然青霉素可以杀死葡萄球菌，就有可能杀死能使人致病的细菌。在牛津大学主持病理研究工作的澳 大利亚病理学家弗洛里和德国的生物化学家钱恩，仔细阅读了弗莱明关于青霉素的论文，对这种能杀灭多 种病菌的物质产生了浓厚的兴趣。但是他们知道，要提取出这种物质，需要各方面科学家的共同努力。他 邀请了一些生物学家、生物化学家和病理学家，组成了一个联合实验组。在弗洛里的领导下，联合实验组 开展了紧张的研制工作。微生物学家们每天要配制几十吨培养液，把它们灌入一个个培养瓶中，在里面接 种青霉菌菌种，等它充分繁殖后，再装进大罐里，送到钱恩那里进行提炼。提

28、炼工作繁重而艰难，一大罐培养液只能提炼出针尖大小的一点点青霉素。经过几个月的辛勤工作， 钱恩提取出了一小匙青霉素。把它溶解在水中，用来杀灭葡萄球菌，效果很好。即使把它稀释200万倍， 仍然对葡萄球菌具有杀灭能力。联合实验组选择了 50只小白鼠来进行试验：把每只都注射了同样数量，足以致死的链球菌，然后， 给其中25只注射青霉素，另外25只不注射。实验结果是不注射青霉素的小白鼠全部死亡，而注射的只有 一只死去。随后，他们开始了更大量的提取工作，终于获得了能救活一个病人所需的青霉素。医生第一次用青 霉素救治了一位患败血症的危重病人，使当时无法治疗的败血症病人恢复了健康，这引起巨大的震动。于 是青霉素

29、一时成了家喻户晓的、比黄金还要贵重的救命药物。这时，弗洛里清醒地意识到，为使青霉素能广泛地用于临床治疗，满足战争的需要，必须改进方法 和设备，进行大规模生产。但这对联合实验组来说非常困难，因为当时伦敦正遭受德国飞机的频繁轰炸， 要进行大规模生产也很不安全。1941年6月，弗洛里不顾钱恩的反对，带着青霉素样品来到不受战火影响 的美国。他马上与美国的科学家们开始合作，经过共同努力，终于研究成以玉米汁为培养基，在24。的 温度下进行发酵的方法和设备，并提炼出了青霉素，产品的纯度和产量也有了大幅度提高，因而在1943年 实现了青霉素的工业化生产，并很快开始了在临床上的应用。这三位科学家的发现，使青霉素

30、进入了人类生活，开创了抗生素时代，挽救了成千上万人的生命， 使人类与疾病的斗争进入了一个全新的时代，为增进人类的健康作出了巨大贡献。为此，他们三人共同获 得了 1945年的诺贝尔生理学或医学奖。青霉素的发现和工业化生产，给人们带来巨大启迪。不久，链霉素、金霉素、新霉素等相继问世， 从而兴起了一个新的工业抗生素工业。抗生素生产的经验和设备很快被引用到其他发酵产品的生产上， 极大地促进了这些产业的迅速发展，形成一个全新的产业现代发酵工业。20世纪60年代的氨基酸发酵工业，70年代的酶制剂工业，80年代的多糖、维生素发酵工业、90年 代生物大分子发酵技术的相继诞生。原来采用固体培养和表面培养的一些传

31、统发酵工业产品，也都相继改 用液体深层培养法进行生产，使其生产效率大幅度提高，规模不断扩大，成本下降，产品类型不断增加。 这个时期生产技术要求高（由于多为好氧纯种发酵，需要通入无菌空气和保持无菌条件）；生产规模大（用 于青霉素生产的搅拌通气发酵罐的体积达到500 m3，单细胞蛋白生产用的气升式发酵罐已达到2 000m3）； 技术发展速度快；因此，菌种的生产能力大幅度提高，新产品、新技术、新设备的应用达到前所未有的程 度。（4）生物技术产业时代：1953年，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，为DNA重组奠定了基础，标 志一个新的学科一一生物技术的诞生。1973年，波依尔（Boyer）和科恩（Co

32、hen）首次在实验室里实现了 基因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门，使人们有可能按照自己的意志改造和设计新的生命体。 1977年，波依尔首次用基因重组获得生长激素抑制因子克隆，1978年，吉尔波特（Gilbert）获得鼠胰岛 素的克隆。几年后，第一个基因工程产品一一利用构建的基因工程菌生产人胰岛素获得成功。人类进入了 生物技术产业时代。现在人们可以将源于动物或植物，甚至源于人的基因，转移到诸如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母等微 生物中，获得具有特殊生产能力的基因工程菌。由于基因表达的产物均为蛋白质，因此在工业上利用基因 工程菌大规模生产的产品，主要是用于治疗各种疾病的药物，又称为基因工程药物

33、（如人胰岛素、人干扰 素、人生长激素等，大约有40多种），同样也可以生产用于不同目的的酶（比如用于将葡萄糖转化为高果 糖糖浆的葡萄糖异构酶，用于生产青霉素母核的青霉素酰化酶，用在洗衣粉中的碱性蛋白酶，等等）。除 了利用基因工程开发新的产品外，利用基因工程对传统发酵和现代发酵工业上使用的菌种进行改造，也获得 了巨大成功。随着分子遗传学和DNA重组技术的不断进步，诞生了通过改变基因中的某些核苷酸，来改变基因及 其表达产物一一蛋白质的结构和性质的蛋白质工程，以及通过基因克隆和基因消除等手段，改造和调控微 生物代谢途径，达到大幅度提高微生物的某种产物的生产能力和节约原料的目的，这称为代谢工程。比如，

34、在充分了解了青霉素的合成代谢途径和相关代谢的基础上，将能够消耗能量和合成原料的代谢旁路的关键 基因消除或控制，将合成青霉素代谢途径中的处于瓶颈的控制基因再克隆，增加关键酶的数量，等于将瓶 颈扩大，达到加大青霉素合成代谢流的目的，可以大幅度提高青霉素的产量。通过对原青霉素生产菌的代 谢工程的改造，使青霉素的发酵达到了 10万单位/毫升的水平。为了解决细胞或细胞内含物生产的问题， 结合基因工程菌、蛋白质工程菌、代谢工程菌在生产上应用，发展了高密度培养技术，使细胞产量可以达 到前所未有的180 g/L的水平。生物技术的发展为传统发酵工业的改造和现代发酵工业的发展提供了无限 的生机。7. 有哪些因素会

35、影响发酵生产？发酵生产过程中，以下因素会影响发酵效果。 菌种发酵是利用微生物来生产产品，因此菌种至关重要。现在工业上用于生产青霉素的微生物 主要是青霉菌，生产味精的微生物是棒状杆菌，生产柠檬酸的微生物主要是黑曲霉。这是因为每一种微生 物的代谢特征不同，它们产生特定产物的能力也不同。为了利用发酵生产所需的产物，不是随便拿来一个 菌种就行。直接从自然界分离到的微生物不一定具有生产特定产物的能力，须在实验室里对几百株、数千 株微生物进行筛选。即使得到了产生特定产物能力的菌株，其生产能力和性能也不见得能够满足生产的需 要，还须经过诱变选育得到高产、性能优良的菌种。即使利用基因工程构建的具有特殊生产能力

36、的工程菌， 都还要对其进行仔细研究，全面了解产生产物的规律、影响菌株产生产物的各种因素和它们之间的关系， 以及控制办法，并在实验室里进行验证和扩大规模的验证，才能够用于生产。在大规模工业生产上有了优 良的生产菌种还不够，必须通过适当的措施提供足够量的种子。 发酵培养基现在大规模工业发酵产品的生产，多采用液体培养基进行深层发酵。使用的培养基 必须满足微生物细胞生长、繁殖的需要，因为没有大量的细胞就不可能产生大量的产物；但是细胞的过分 生长会消耗大量的营养物，有时又会影响细胞的生产能力，会使产物的产量和产率下降。使用的培养基还 必须有利于微生物大量合成产物。因此，培养基的组成十分关键。 纯种发酵与

37、灭菌现代发酵工业绝大多数采用纯种发酵，可以保证高产及生产过程和产品质量的 稳定。污染是发酵工业的大敌，它会使发酵失败，造成巨大损失。因此，灭菌和无菌操作成为发酵工业的 重要环节。发酵涉及到的设备，如发酵罐、空气过滤系统、管道、阀门、取样设备等均必须用120。以上的高 压蒸汽进行彻底灭菌，把存在的所有微生物杀死。配制好的培养基在进入发酵罐之前要加热到120 C以上， 进行灭菌，或进入时采用连续高温灭菌的方法进行灭菌，即将与发酵关联的所有系统进行灭菌，然后使系 统降温到发酵温度后，接入种子，开始发酵。只有这样才能保证接入的菌种不受污染，进行正常发酵。如 果灭菌不彻底，哪怕有很少量的杂菌没有被杀死，

38、也会在发酵过程中大量繁殖，造成污染，使发酵失败。 温度对微生物生长的影响温度主要是通过影响微生物细胞内生物大分子的活性来影响微生物 的生命活动。一方面，随着温度的升高，细胞内的酶反应速度加快；另一方面，随着温度的进一步增高， 生物活性物质（蛋白质，核酸等）发生变性，细胞功能下降，甚至死亡。所以，每种微生物都有个最适生 长温度。作为整体，微生物可在-1095 C范围中生长，极端下限为-30 C，极端上限为105300 C。 但对于某一种特定的微生物来说，则只能在一定的温度范围内生长。温度下限和上限分别称为微生物的最 低和最高生长温度。当低于或高于最低或最高生长温度，微生物就停止生长，甚至死亡。需

39、要指出的是，微生物不同的生理活动需要在不同的温度条件下进行，所以，生长速率、发酵速度、 代谢产物积累速度的最适温度往往不在同一温度下。例如，乳酸链球菌在34 C时繁殖速度最快，2530 C 时细胞产量最高，40 C时发酵速度最快，30 C时乳酸产量最高。其他微生物也有类似特点。在较高温度下，细胞分裂虽然较快，但维持时间不长，容易老化；相反，在较低温度下，细胞分裂 虽然较慢，但维持时间长，细胞的总产量反而较高。同样，发酵速度与代谢产物积累之间也有类似关系。研究不同微生物在生长或积累代谢产物阶段时 的最适温度，采用变温发酵，对提高发酵生产效率具有重要意义。 pH对微生物生长的影响 培养基的pH对微

40、生物生长的影响主要是引起细胞膜电荷变化，以及影 响营养物离子化程度，从而影响微生物对营养物的吸收；pH也会影响生物活性物质，如酶的活性。与温度对微生物的影响类似，微生物存在最低生长pH、最适生长pH和最高生长pH。不同微生物对 环境pH适应的范围不同。一般微生物生长的最适pH在4.09.0范围内。真菌生长的范围宽，细菌较窄（3 4pH单位），细菌、放线菌一般适应于中性偏碱性环境，而酵母、霉菌适应于偏酸性环境。最适生长pH偏 酸性的微生物，称为嗜酸性微生物；其中不能在中性环境生长的称专性嗜酸微生物，如乳酸杆菌和假单胞 杆菌；既能适应酸性，也能在中性环境中生长的称兼性嗜酸菌；最适生长pH偏碱性的称

41、嗜碱性微生物，如 链霉菌。同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH也有不同要求。如丙酮丁醇梭菌 在pH为5.57.0时，以菌体生长繁殖为主；pH为4.35.3时，才进行丙酮丁醇发酵。同一种微生物由于培养环境pH不同，可能积累不同的代谢产物。如黑曲霉在pH为23的环境中发 酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH接近中性时，则大量产生草酸，而柠檬酸产量很低。 又如酵母菌在最适pH时，进行乙醇发酵，不产生甘油和醋酸；如果环境pH大于8,发酵产物除乙醇外， 还有甘油和醋酸。因此，在发酵过程中，根据不同目的，采用变pH发酵，可以控制产物和生产效率。大多数微生物能分解糖，产

42、生酸性物质，造成pH下降。少数微生物能分解尿素成氨，使环境pH上 升，蛋白质脱羧反应也会使pH上升。所以，微生物的代谢活动会改变环境pH，影响其生存。pH变化的程 度与培养基的C/N比有关，C/N比高，则pH下降明显；反之，pH有可能会上升。有时为了控制发酵液的 pH需要通过加入酸碱进行调节。 溶氧的影响 工业上大部分为好氧发酵，如抗生素、氨基酸、维生素、多糖、有机酸（细菌发酵 生产乳酸例外）等发酵均需要往发酵液中通入无菌空气，以满足微生物生长代谢过程对氧的需求；而酒精、 丙酮、丁醇和乳酸的细菌发酵为厌氧发酵，发酵过程不需要氧。对于好氧发酵的工业生产，如何保证发酵液中氧的供给，满足微生物对氧的

43、需求，使氧的供、需矛 盾不会成为生产的限制因素，是稳定和提高生产、降低成本的关键之一。在发酵过程中氧的供给够不够， 只凭通气量的大小是难以确定的。由于发酵过程随着微生物的繁殖、营养物的消耗和代谢产物的积累，发 酵液的物理、化学和生物学性质均会发生改变，这时尽管通气量不变，氧在培养基中的溶解速度和浓度均 会发生变化。为了了解和掌握氧对发酵的影响，最简单而有效的办法是就地测定发酵液中的氧浓度，从氧 浓度的变化情况了解氧的供需规律和它的变化对生产的影响。在好氧发酵时，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。为什么氧会成为限制因素，而不是其他营养 物？关键是与其他营养物相比，氧在溶液中的溶解度和溶解速度很低，如果不采取适当措施，氧的供给就 会成为限制因素。微生物在不同发酵阶段，因其生长、代谢水平的变化，对氧的需求量也有变化，因此，控制发酵液 的溶氧可以达到提高生产水平的目的。发酵液中溶氧浓度可以通过控制通气量、罐压、搅拌速度等控制氧的溶解速度和浓度。可以看出，发酵过程对周围环境的物理和化学条件十分敏感，任何一种微生物发酵均需要适当的温 度、pH、溶解氧、营养物质，保证最适的发酵条件是发酵成功获得高产产品的关键。