蛋白质工程论文

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1、蛋白质工程 学末 论文学院：生命与地理科学学院班级：10级生物工程姓名：吉毛措学号：20101911242目录摘要、关键词-3英文翻译-41. 蛋白质工程-51.1蛋白质工程的诞生-51.2蛋白质工程的概述-52. 蛋白质工程的应用抗体工程-62.1抗体工程的研究现状和发展前景-7（1）多克隆抗体-7（2）单克隆抗体（杂交瘤技术）-10（3）基因工程抗体(人源化抗体)-173.抗体融合蛋白-21 3.1免疫毒素-18 3.2基因工程抗体酶融合蛋白-21 3.3基因工程抗体细胞因子融合蛋白-224.注释-235.参考文献-23蛋白质工程在抗体工程方面的应用与发展摘要：蛋白质工程是在基因重组技术、

2、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等学科而发展起来的综合性研究邻域。蛋白质工程的出现，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段，在揭示蛋白质形成和功能表达的关系研究中发挥了重要作用。它不仅可以带动生物技术进一步发展，还可以推动与人类生产、生活关系密切的相关科学的发展。已有研究表明，蛋白质工程在医药、工业、农业等各行各业中均具有广阔的应用前景。随着蛋白质工程研究对象的扩大和技术的成熟，其应用领域也将不断拓宽。本论文就以抗体工程中单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体等的研究现状和抗体融合蛋白、杂交瘤技术、人源化抗体等为例介

3、绍蛋白质工程的应用情况和发展概况。关键词：单克隆抗体 多克隆抗体 基因工程抗体 抗体融合蛋白 杂交瘤技术 人源化抗体 Applicationanddevelopmentofproteinengineeringinantibodyengineering Abstract:ProteinengineeringisthebasisofrecombinantDNAtechnology,biochemistry,molecularbiology,moleculargeneticsandotherdisciplines,thefusionproteincrystallography,proteindyna

4、mics,proteinchemistryandotherdisciplinesascomputer-aideddesignanddevelopacomprehensiveresearchneighborhood.Theemergenceofproteinengineering,inordertounderstandandtransformtheproteinmoleculesprovidesapowerfulinstrument,playedanimportantroleinthestudyoftherelationshipbetweentorevealproteinformationand

5、functionalexpression.Itcannotonlydrivethefurtherdevelopmentofbiotechnology,canalsopromotethedevelopmentofscienceandhumanproductionandlifearecloselyrelated.Studieshaveshownthatproteinengineeringhasbroadprospectsforapplicationinmedicine,industry,agricultureandotherindustries.Withtheexpansionoftheobjec

6、tofproteinengineeringandtechnologymature,willalsocontinuetobroadenitsapplications.Thepapersonantibodyengineeringmonoclonalantibodies,polyclonalantibodies,geneticallyengineeredantibodyResearchandantibodyfusionprotein,hybridomatechnology,humanizedantibodies,forexampletointroducetheapplicationofprotein

7、engineeringanddevelopmentoverview.Keywords:Monoclonalantibodiespolyclonalantibodiesgeneticallyengineeredantibodyantibodyfusionproteinhybridomatechniquehumanizedantibody.1.蛋白质工程 定义：是研究蛋白质分子结构规律与生物学功能的关系，对现有蛋白质加以定向修饰改造、设计和剪切，构建生物学功能比天然蛋白质更加优良的新型蛋白。从预期功能出发，设计期望结构、合成目的基因并有效表达或通过定向诱变、定向修饰和改造等一系列工序，合成优良蛋白

8、。1.1蛋白质工程的诞生 我们知道生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中产生的，它的结构性能已经不能完全满足人类生产生活的需要。例如：干扰素是一种动物体内的抗病毒、抗肿瘤的药物蛋白，但在体外保存相当困难，以及其需求量日益增加。于是我们要对现有的蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质来满足人类生产和生活的需要。这样人们就开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。 早在80 年代初美国Genex 公司K. U lm er第一次提出蛋白质工程概念, 并建立了专门研究实体, 制定了相应研究开发计划。其后,以美国为首的几家生物技术公司同时应用蛋白质工程技术得到几种蛋白质结构, 标志着蛋白

9、质工程正式诞生。1.2蛋白质工程的概述 目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。蛋白质工程的原理：基因改造基本途径：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）蛋白质工程的流程：（如下图） 3. 蛋白质工程的应用抗体工程 抗体不仅在哺乳动物机体中担负着重要的体液免疫功能, 还在医学、生物学免疫诊断中被广泛地应用。本世纪证明了抗体是一类免疫球蛋白, 并相继阐明了抗体产生及其多样性的细胞和分子机制, 使免疫学研究成为生命科学前沿领域。Porter等对血清IgG抗体的研究证明，Ig分子的基本结构是由四肽链组。即由二条相同的

10、分子量较小的肽链称为轻链和二条相同的分子量较大的肽链称为重链组成的。轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本结构。Ig单体中四条肽链两端游离的氨基或羧基的方向是一致的，分别命名为氨基端（N端）和羧基端（C端）。Ig分子 酶水解片段示意图随着生命科学技术的发展，抗体的制备技术也经历着一次又一次革命, 由血清抗体到杂交瘤单克隆抗体, 再到基因工程抗体库技术, 可谓日新月异。下面主要是介绍杂交瘤单抗克隆技术，以及其遇到的问题是如何通过蛋白质工程加以解决的。2.1抗体工程的研究现状和发展前景 （1）多克隆抗体（polyclonal antibody）：抗

11、原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。 抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结

12、构，叫做抗原决定簇。一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。只针对一个抗原决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系，纯系的英文为Clone，音译就是克隆。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。 多克隆抗体又简称多抗。与之相对应的叫单克隆抗体，简称单抗。抗原准备概述可以作为抗原的物质有很多种，一般的科研实验中，经常使用的抗原有：偶联多肽、偶联的小分子或

13、化合物、天然或重组蛋白等等。 对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。 佐剂应用1佐剂的类型 目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡 油等。也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。 弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant,IFA） 羊毛脂 1 份 石蜡油 5 份 混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至 50左右，加抗原进行乳化处理。 弗氏完全佐剂（complete Freunds adjuvant,CFA） 弗氏不完全佐剂 10ml 卡

14、介苗 10mg200mg 卡介苗可 10010min 灭活处理。 初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐剂。但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干扰。 脂质体：是人工制备的类脂质的小球体，由一个或多个酷似细胞膜的类脂双分子层组成，这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性物质，他们被包裹在脂质体内部的水相中，或插入类脂双分子层或吸附、联接在脂质体的表面，起到明显的免疫增强作用。 油佐剂 ：采用植物油和矿物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。目前应用最广的矿物油。 10 号 白油(石蜡油) 10

15、0ml 硬脂酸铝 2g 司本 80 6ml 混合加热融化，分装。用时按下列配方进行乳化。 油相 3 份 水相（加 4%吐温80） 1 份 先把油相搅拌起来，然后缓慢加入水相乳化。司本是油分散剂，吐温是水分散剂，均有利于 乳化。 乳化作用将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。乳化的方法很多，可采用研钵乳化；可直接在旋涡振荡器上乳化；可用组织捣碎器乳化。少量时，特别是弗氏佐剂与抗原乳化时，常采用注射器乳化，用两个注射器，一个吸入抗原液，一个吸入佐剂，两注射器头以胶管连接，注意一定扎紧，然后来回抽吸。当大量乳化时，可采用胶体磨进行。 乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未

16、乳化好。乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现。 根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。 免疫途径包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射以及淋巴结内注射等。抗原量少，则一般多采用加佐剂，淋巴结内或淋巴结周围、或足掌、或皮内、皮下多点注射，如抗原量多，则可采用皮下、肌肉、以至静脉注射。 注射间隔时间 带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔 24 周免疫一次。不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为 12 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可 5 天左右的间隔时间。 可以把各种注射途径联合起来应用，最终以达到效价要求为目的。 免

17、疫动物供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。 免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。 抗原是多种多样的，而且千差万别。就其化学

18、成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的 cDNA 文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。 抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言，

19、小鼠的首次免疫剂量为 50g400g/次， 大鼠为100g1 000g/次， 兔为 200g1 000g/2次。加强剂量为首次剂量的 1/52/5。 免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射 0.5mg1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10 倍以上。如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法。如需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫周期短者，应大量少次。 两次注射的间隔时

20、间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般间隔时间应为 57 天，加佐剂者应为 2 周左右。 注射的 Ig 纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。 除此之外，多克隆抗体也可研究并开发成抗体药物。例thymoglobulin（兔抗胸腺细胞球蛋白）是美国Sangstat公司的新产品，是用人胸腺细胞免疫家兔后纯化其中的免疫球蛋白得到多抗药物。美国FDA先后批准了thymoglobulin用于治疗肾移植手术的急性排异反应，和作为脊髓发育不良综合症（MDS）的指定用药。2002年，该药在加拿大也获准使

21、用。（2）单克隆抗体（monoclonal AB， MCAB）：动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。

22、一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞1。 2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能

23、利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特

24、异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培

25、养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。 抗原准备抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。 很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射1050ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物免疫单克隆抗体制备的宿主动物一般选用Balb/c小鼠，鼠单抗的应

26、用范围相当广泛，也有一些公司声称开发出了兔的单克隆抗体制备技术。 免疫原分为可溶性抗原和颗粒性（细胞）抗原，用无菌盐水稀释并与佐剂混合，腹腔注射抗原与佐剂彻底混匀后形成的稳定乳状液，在免疫原提供持续的免疫应答基础上进行加强免疫 周期 第1天 采血0.2ml（获得0.1ml免疫前血清） 第一次免疫（抗原加弗氏完全佐剂） 第14天 第二次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第21天 采血和ELISA检测 第35天 第三次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第42天 采血和ELISA检测 第56天 第四次免疫（抗原溶于PBS或盐水） 第61天 细胞融合 细胞融合（一）融合剂 细胞融合的方法有物理法，如电融合、激

27、光融合，化学融合法和生物融合法，如灭活的仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量为200700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，pH8.0pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却

28、有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。 （二）融合过程 融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。 1试剂与材料 (1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。 (2)1640培养液100ml。 (3)完全1640液100ml。 (4)2.5%FCS1640液50ml。 (5)HAT培养液100ml。 (6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40的1640液10ml等量（W/V）

29、混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。 (7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。 (8)40孔塑料培养盘。 2操作方法 准备好脾细胞。 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5%FCS1640液。 室温400g离心3min，使细胞沉淀。 移去上清液。 轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40水浴中，使其达融合温度。 加预热至40的50%PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。 加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。 重复一次。 加1ml1

30、640液，边加边摇动，持续0.5min。 重复一次。 加1640液15ml。 室温，400g离心1min，使细胞沉淀。 去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。 往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。 轻摇后，放入5%CO2饱和湿度的37温箱中培育。 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在1

31、020天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。 （三）细胞融合的关键 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。杂交瘤技术：克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到

32、的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的1001000倍。 利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。（流程图） 通过结构分析表明, 抗体可变区内具有6 个互补决定区(CDR ) 起与抗原结合作用, 其它区域做为支架(FR ) 维持

33、构象, 通过CDR 移植已构了30 多种改型的人源化鼠抗（一种改型抗体）, 并通过序列分析比较和计算机模拟进行分子设计, 对FR 区特定碱基进行替换, 保证了改型后抗体亲和力不下降, 这种抗体有人称之为第二代基因工程抗体, 亦即蛋白质工程抗体。虽然单克隆抗体给人类疾病的药物导向治疗带来了曙光, 但应用上遇到鼠抗体对人具有免疫原作用的问题, 蛋白质工程已成功用于解决这个问题。 由于单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、少有交叉反应的优点，已经广泛用于生命科学的各领域，如作为诊断试剂用于许多血清学检测，用于治疗肿瘤、自身免疫疾病，抑制同种异体移植排异反应等。例如，利妥西单抗（rituimab）是

34、美国FDA批准的首个抗肿瘤单抗。首先用人B淋巴细胞免疫小鼠，然后筛选鼠源抗CD20的单克隆抗体，再利用基因工程技术将鼠源CD20抗体的可变区与人IgG1恒定区连接而成。现在解决抗体人源化问题主要是通过基因工程技术，正如上文举例。单克隆抗体的优点与局限性1单克隆抗体的优点(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。 (2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。 (3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。 (4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生

35、物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 2单克隆抗体的局限性(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。 (3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 行业发展情况销售及增长2010年全球治疗用单抗药物的销售总额达到440亿美元，如果加上100亿美元的单抗诊断和研究试剂，单抗药物的市场总量达到550亿美元。2011年单抗药物的市场总量已经达到628亿美元。未来，全球单克隆抗体药依旧会保持较高的增长率。到2015年，全球单克隆抗

36、体药销售额有望达980亿美元左右。我国的单克隆抗体药物从无到有，并且在我国医药市场发挥越来越重要的作用。目前我国单抗市场规模每年以50%以上的速度递增。单克隆抗体在我国市场仍属高端产品，主要依赖进口。罗氏是我国单抗市场最大的赢家，市场份额最高的品种利妥昔单抗和曲妥珠单抗均来自罗氏制药，罗氏所有产品份额超过国内单抗产品份额半数。2010年我国肿瘤药物市场销售额达160亿元，同比增长24%，全球排名第七，远超美国4.4%和其他成熟或新兴市场；2011年市场销售额达到208亿元。同比增长率30%。对生物仿制药的市场渗透率形成制约的其中一个因素是立法，它阻止了用生物仿制药来替代原研产品。这意味着，生物

37、仿制药的使用只限于新病人和短期适应症。然而，使用生物仿制药创造的医疗成本控制机会却是巨大的。在那些尚未为生物仿制药确定监管路径的市场上（其中包括美国），生物仿制药获得成功的关键因素是专利的独有性、临床试验要求和互换性。 研发的政策支持十二五期间，我国重大新药创制专项将获中央财政下拨资金100亿元，配套资金300亿元。专项战略重点包括创新药物研究开发、药物大品种技术改造等。恶性肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、肺结核等10类重大疾病药物的研发是创制资金支持重点。十二五期间，医药工业发展目标为总产值年均增长20%，到2015年达到3.1万亿元。2011年，单克隆抗体药物继续领跑全球药品市

38、场，同比有较大的增长。2000-2010年10年间，全球单克隆抗体药物市场的复合增长率高达32%。2011年，全球处方药前20位中，有6个为单克隆抗体药物，其中有5个销售额超过50亿美元。而在此前的2009年和2008年，该数字分别为400亿美元和370亿美元。当前，几乎所有大型制药公司都有单抗研发项目。在2011年全球最畅销的20种药品中，美国辉瑞公司用于降低胆固醇的阿托伐他汀钙居于首位，达到133亿美元。2011年，全球生物制药产品的市场规模超过1550亿美元，占制药/生物制药产品的25%。不过，有研究数据表明，生物制药产品今后几年在全球市场上的占比将明显上升。据预测，到2014年，全球销

39、售额前三大产品都将是生物技术药物（Avastin，Humira和Enbrel），届时它们的销售额合计将达到254亿美元。单克隆抗体药物已经成为生物制药中最为重要的一类：2011年销售规模最大的7种抗体药物的销售额达到了388.2亿美元，占整个生物制药市场份额接近50%；单克隆抗体仍是目前研发的热点，也将是未来生物制药行业发展的重要动力所在。 （3）基因工程抗体（genetically engineering antibody）: 基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的生物药物总称。 由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从而减弱

40、或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体。基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。基因工程抗体发展细胞内抗体 ；最近，美国FDA强调：目前在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30%。重组抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或与其它分子相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒。重组技术的出现使筛选、人源化、抗体的生产得到革新，并取代杂交瘤技术，从而使以抗体为基础

41、的药剂设计成为可能。 由于杂交瘤单克隆抗体为异源性蛋白，应用于人时易产生抗小鼠抗体，基因工程抗体通过基因工程技术改造现有优良的鼠单克隆抗体基因。尽量减少抗体中鼠源成分，保留原有抗体特异性，从而创造出一种新型抗体。一、人源化抗体人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。1.人-鼠嵌合抗体此抗体为通过基因工程技术，将人IgG C区与鼠IgV区连接，导入细胞内表达制备而成的抗体。2.抗体的表面修饰，使Fv表面人源化。二、小分子抗体此为分子量小，具有抗原结合

42、功能的分子片段，包括Fab，Fv，单链抗体，医学教*育网整理单区抗体等。此种抗体分子量小，可在大肠杆菌等原核细胞表达，在人体内穿透力强，有利于疾病的治疗。三、抗体融合蛋白将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到多样性生物功能的融合蛋白，如：1.含Fv段的抗体融合蛋白：将Fv与某些毒素、酶、细胞因子基因拼连，通过这些抗体的引导，可将其生物活性物质导向靶细胞特定部位，所谓“生物导弹”。2.嵌合受体：将ScFv与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白，可表达于细胞表面，称为嵌合受体，由于其介导的杀伤效应不受MHC限制，在过继性免疫治疗中有潜在应用价值。3.含Fc的抗体融合蛋白：CD4分子细胞膜外部分与F

43、c融合后由真核细胞表达。此融合蛋白能竞争结合HIV，阻断HIV对敏感细胞的感染；还可介导ADCC及CDC，可通过胎盘。四、特异性抗体双特异性不同的两个小分子抗体医学教*育网整理连接在一起可得到双特异性抗体。双特异性抗体能同时结合两种抗原，因而可介导标记物与靶抗原结合或某些效应因子定位于靶细胞，在免疫学检测中可简化操作步骤，提高检验质量；应用双特异性抗体介导的药物杀伤效应可用于肿瘤等的治疗。五、抗体库技术抗体库技术是指基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变区基因克隆出来，重组到质粒表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，最后筛选到特异的可变区基因，现有组合抗体库技术及菌体抗体库技术。3

44、.抗体融合蛋白（hybrid molecule）: 将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到多样性生物功能的融合蛋白，如：1.含Fv段的抗体融合蛋白：将Fv与某些毒素、酶、细胞因子基因拼连，通过这些抗体的引导，可将其生物活性物质导向靶细胞特定部位，所谓“生物导弹”。2.嵌合受体：将ScFv与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白医学教|育网搜集整理，可表达于细胞表面，称为嵌合受体，由于其介导的杀伤效应不受MHC限制，在过继性免疫治疗中有潜在应用价值。3.含Fc的抗体融合蛋白：CD4分子细胞膜外部分与Fc融合后由真核细胞表达。此融合蛋白能竞争结合HIV，阻断HIV对敏感细胞的感染；还可介导ADCC及

45、CDC，可通过胎盘。(1)免疫毒素（ITS）: 又称抗毒素(antitoxin)。外毒素（来自动植物或细菌的毒素）的对应抗体或含这种抗体的抗毒素血清。机体经感染某种传染病或被注射外毒素时即能产生。通常制备系以外毒素注射于马体，使马产生免疫毒素，然后取其血清加工提纯即得（血清不提纯也可直接应用）。用于防治相应的疾病。被用于把高效药剂送到特定的区域，特别是送入癌细胞。恶性肿瘤是危害人类健康 的一类重要疾病 ，随着人类生存 环境的恶化和社会压力的增大 ，恶性肿瘤的发病率和病死率逐渐增高，每年全球癌症死亡人数约为700万人。肿瘤的治疗以外科手术为主，以放化疗为辅 ，但放化疗缺乏特异性 ，对正常组织器官

46、的毒副作用较大，使患者身心备受影响。对肿瘤的特异性治疗一直是医学工作者的梦想。免疫毒素作用机理：免疫毒素分子中受体结合域与靶细胞表面相应抗原或受体的结合；免疫毒素分子的转位结合域，通过内化和跨膜转运过程 , 转运到细胞质中；免疫毒素分子的催化结构域，通过胞内催化抑制蛋白质合成 ，或诱导凋亡。1. 免疫毒素总体发展第一代免疫毒素是化学交联免疫毒素;第二代免疫毒素是抗体或抗体的活性片段与双链毒素A 链或单链RIP 的化学偶联物,第三代免疫毒素是基因工程免疫毒素.2.第一第二代免疫毒素与第三代免疫毒素的比较：（下表）免疫毒素第一代第二代第三代结构组成完整的抗体与毒素抗体片段与改造毒素抗体片段与改造毒

47、素制备方法体外化学交联体外化学交联宿主菌体内重组表达优缺点稳定性差、分子量大、免疫原性强、渗透性差稳定性差、分子量大、免疫原性强、渗透性差稳定性强，渗透性好，特异性更好，制备时简单易行，可短期内大量制备2.分别对于抗体，毒素和其他方面的研究进展对抗体的研究：完整Ig分子量大，渗透性差，应用过程中受到一定的限制；FV是能介导特异性结合的最小抗体亚单位。在轻链和重链可变区用一个连接肽连接，保留其稳定性的同时充分保留了特异性结合能力，且免疫原性大大降低；通过二硫键相连，scFV与dsFV免疫毒素的体外实验显示，两者活性及特异性相似，但dsFV的产量高，对热和化学处理有耐受作用，在各种缓冲液及人血清中

48、较稳定。对于毒素的研究：制备免疫毒素最常用的毒素有白喉毒素、蓖麻毒素、假单胞杆菌外毒素和其它毒素。 其他方面的研究a) 免疫毒素在体内的清除及降低其清除速度的研究应用免疫毒素的重要目的是治疗肿瘤。应用中一个令人关心的问题是它的体内清除，降低免疫毒素在体内的清除速度，延长其半衰期，在免疫毒素的应用研究中具有重要的意义Thorpe等(1985)发现用高碘酸处理，并经氰硼氢化钠还原的蓖麻毒素，发现毒素在小鼠体内的清除速度，不像天然毒素那么快。修饰过的毒素对培养细胞的毒性仅及天然毒素的1/10，但在动物体内其毒性却是天然毒素的4倍b) 免疫毒素在小鼠体内应用的研究毒素在小鼠体内的药物动力学、对肿瘤的定

49、位能力以及治疗肿瘤效果的研究，是免疫毒素应用于临床的重要研究方面3. 免疫毒素在体内肿瘤治疗的中的问题特异性：免疫毒素的特异性是进行导向治疗的前提，它取决于所用载体如抗体或细胞因子的特异性；寻找肿瘤细胞表面特异性表达的受体或抗原活性：取决于其半衰期与稳定性，而半衰期与稳定性则取决于免疫毒素的大小及其与肿瘤的亲和力，研究如何使免疫毒素有较长的半衰期和较好稳定性也是急需解决的问题；毒性：对毒素分子和运载体进行克隆修饰，降低其非特异性细胞毒性作用；免疫原性：主要取决于毒素部分，多年的临床试验表明，50 100的实体瘤病人和 040的血液瘤病人在经 过一轮的免疫毒素治疗后 ，会产生针对免疫毒素的抗体

50、。当产生的抗体为中和性抗体时 ，免疫毒素的细胞毒作用就会降低，设法尽量减小免疫原性；毒副作用：最常见的副作用为血管渗漏综合征(vesselleak syndrome，VL s)这是因为免疫毒素从血管到达靶器官必须穿过血管内皮细胞，还有对肝脏毒性 ， 这是Fv的残基 与带负电荷的肝细胞结合导致的 。尽管免疫毒素导向治疗肿瘤尚存在一些问题，但已显示出很大的临床应用前景。随着蛋白质及基因工程技术的深入研究，免疫毒素导向治疗恶性肿瘤必将成为行之有效的治疗手段。 （2）基因工程抗体-酶融合蛋白（ADEPT）：抗体融合蛋白(antibodyfusionprotein)是指利用基因工程技术将抗体片段与其他生

51、物活性蛋白融合所得的产物。由于融合蛋白的不同，这种抗体融合蛋白具有多种生物学功能，并且表达的重组蛋白既不影响单链抗体的抗原结合能力，也不影响与之融合的蛋白质的生物学特性。如将ScFv与某些细胞膜蛋白融合，可形成嵌合受体，赋予特定细胞结合某种抗原的能力；如将Fab或ScFv与其他生物活性蛋白融合，就可将特定的生物学效应物质导向靶部位。尽管多克隆抗体和单克隆抗体得到了广泛的应用，但它们还有许多难以克服的缺点。特别是在治疗的研究方面，由于以往的抗体来自异种动物，所以抗原性很强，不能直接用于人体，否则会引起很强的免疫排斥反应。为此在20世纪80年代诞生了应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不同

52、需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，称为基因工程抗体(geneticengineeringantibody，GEAb)。基因工程抗体具有如下优点：通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；根据治疗的需要，制备新型抗体；可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本。将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到多样性生物功能的融合蛋白，如：1.含Fv段的抗体融合蛋白：将Fv与某些毒素、酶、细胞因子基因拼连，通过这些抗体的引导，可将其生

53、物活性物质导向靶细胞特定部位，所谓“生物导弹”；2.嵌合受体：将ScFv与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白，可表达于细胞表面，称为嵌合受体，由于其介导的杀伤效应不受MHC限制，在过继性免疫治疗中有潜在应用价值。3.含Fc的抗体融合蛋白：CD4分子细胞膜外部分与Fc融合后由真核细胞表达。此融合蛋白能竞争结合HIV，阻断HIV对敏感细胞的感染；还可介导ADCC及CDC，可通过胎盘。研究结果还表明，VL-LDP-AE对体外培养的肿瘤细胞有强烈杀伤作用，还可抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生成。动物实验证实对小鼠移植性肝癌22（H22）的抑制率为百分之89.5。（3）基因工程抗体细胞因子融合蛋白（细胞因

54、子cytokines）: 细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、 分泌的一大类多功能、 高活性的生物物质。它在介导机体多种免疫反应及对各类免疫活性细胞的分化、 发育和活化中起着十分重要的作用。细胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技术是当今免疫学研究的一个热点方向。该方法是基于这些细胞因子具有相同或相关的功能活性而各自作用靶点不同, 利用基因工程技术将两种或多种细胞因子融合在一起, 其融合基因表达产物既具有其组成因子独特的生物学活性或使其某些活性显著提高, 还可能会通过生物学活性的互补及协同效应发挥出较单一细胞因子简单配伍所不具备的复合生物学功能, 甚至

55、还可能会产生一些新的结构及生物学功能, 这种新型的人工蛋白具有极高的应用价值和良好的发展前景细胞因子融合蛋白是近年来国内外研究的热门问题。因为融合蛋白可能具有除相关因子生物活性以外的复合功能,所以被学术界看作为很有前途的第二代细胞因子。随着基因重组技术和蛋白质工程技术的完善和发展,越来越多的有研究与应用价值的新的细胞因子融合蛋白将会被人们发现。4.注释1 嵌合抗体嵌合抗体（ chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起

56、的不良反应，并有助于提高疗效。 2 人源性抗体 是将人抗体的 CDR 代之以鼠源性单克隆抗体的 CDR ，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。 3 完全人源化抗体 采用基因敲除术将小鼠 Ig 基因敲除，代之以人 Ig 基因，然后用 Ag 免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。 4 单链抗体是将 Ig 的 H 链和 L 链的 V 区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链 FV （ single chain fragment of variable region,sFv ）。 SFv 穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。 5 双特异性抗体 将识别效应细胞的抗体和识

57、别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（ CTL 细胞、 NK 细胞、 LAK 细胞）表面分子的抗体（ CD3 抗体或 CD16 抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用 4.MDS:又名“前白血病”，主要表现为骨髓功能异常，无法产生足量的正常细胞。5.参考文献【1】 汪世华.2012.蛋白质工程.北京:科学出版社 【2】 陈宏.2003.基因工程原理与应用.北京:中国农业出版社 【3】 郁子扬, 张立煌. 细胞因子重组融合蛋白研究进展J. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2004, 11(2): 148-150. 【4】 百科自然科学等等 23