免疫学实验技术

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1、免疫学实验技术免疫学实验技术抗体抗体l定义：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。医学应用：科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等1.诊断：各类血清学检测，抗人球蛋白测试，早孕检测 等2.治疗：单克隆抗体疗法（类风湿性关节炎多发性硬化症等），肿瘤治疗。多抗来源多抗来源l动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细

2、胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中，即为多克隆抗体。多克隆抗体制备多克隆抗体制备动物选择：兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。基本步骤基本步骤延长抗原的作用时间增强吞噬作用刺激抗原提呈促进细胞因子分泌诱导淋巴细胞分裂、增殖影响T细

3、胞“极化”佐剂的作用机理：佐剂的作用机理：抗原制备：抗原制备：商品化或自行表达基础免疫：基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐剂（Complate Freund adjuvand,含矿物油,卡介苗等)。加强免疫：加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用佛式不完全佐剂(Incomplate Freund adjuvand,不含卡介苗).取血测效价：取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第7天取血。放血制备血清：放血制备血清：可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉)实验方法实验方法l新西兰大耳白，2000g(雌雄均可),健康,无病原l基础免疫0.5ml抗原(含0.250.5mg蛋

4、白或108颗粒抗原)0.5ml佛式完全佐剂(CFA)制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射l加强免疫间隔2-4周,可进行多次0.5ml抗原(蛋白量减半)0.5ml佛式不完全佐剂(IFA)制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射实验方法实验方法l免疫34次以后从耳静脉取血检测效价酶联法：1:104以上，能达到1:106。免疫双扩散：1:16以上，能达到1:64l效价达到要求的可放血制备血清可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉)多抗的特点多抗的特点l多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。l比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体，多种抗

5、体都可与抗原结合。l特异性相对较差：因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。l 抗体的纯化、标记比单抗难：因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血清中含有的杂蛋白比较多。什么情况下需要制备单克隆抗体什么情况下需要制备单克隆抗体l目的蛋白有结构类似物l抗原不纯，无法分开l多抗效果不好（已排除非特异性反应）l希望将抗体用于治疗，研制成药品l希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂单抗制备原理单抗制备原理l如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对

6、一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。l1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。l利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。单抗制备原理单抗制备原理HGRPT：次

7、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 TK：胸腺嘧啶核苷激酶HAT：次黄嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A)基本步骤基本步骤实验方法实验方法l免疫小鼠l选择体重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制备抗原免疫。50100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。l细胞融合l取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，150

8、0rpm离心5min，去除培养基，用50%PEG（Sigma）作为融合剂，在37下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37，5%CO2的细胞培养器皿中培养。阳性细胞筛选阳性细胞筛选l细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。l阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法，用包被液稀释成110ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4过夜，使其吸

9、附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用110的脱脂奶粉或13 BSA或36牛血清封闭30-60min;加入阳性孔培养上清100ul/孔，37 12 小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37 12小时，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD492的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。获分别对上述抗原有特异性反应的阳性孔。l筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获对上述抗原有特异性反应的杂交瘤细胞株。细胞株进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液

10、氮冻存。杂交瘤细胞的冻存l杂交瘤细胞通常用含有8-10%的二甲亚砜和20小牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年，在-80中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速升温，这样可以确保细胞有较高的存活率。单克隆抗体腹水制备及纯化单克隆抗体腹水制备及纯化l取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。l辛酸辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体：硫酸铵沉淀法纯化抗体：取1倍体积腹水加2倍

11、体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70保存。其他抗体纯化方法其他抗体纯化方法q盐析法（硫酸铵沉淀)q离子交换法q亲和层析法q凝胶过滤法盐析法（硫酸铵沉淀（硫酸铵沉淀)l原理原理在高浓度中性盐存在下,蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀硫酸铵是最常用的中性盐不同蛋白质的盐析常数不同硫酸铵的加入量通常以饱和度表示 (100%饱和度:76

12、7g/L)特点特点成本低，步骤简单。抗体的回收率比较高。抗体纯度比较低，电泳后可见到明显的杂带,不适合于做各种标记。需要高速离心机。正辛酸-硫酸铵沉淀法l原理原理两步沉淀：先加正辛酸去杂蛋白.正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下(pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀.后加硫酸铵使抗体沉淀.n特点特点成本较低，步骤较复杂。抗体回收率很低。抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种标记。需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。离子交换法l原理原理利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离.DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)将样品

13、的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷.采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分.特点特点成本较低，步骤较简单。抗体回收率较高。抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适合于各种标记。纯化后抗体体积大，需要浓缩。需要冷柜，自动收集器。亲和层析法l原理原理利用蛋白质之间的特异性结合 （抗体-抗原，受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配的物质。洗脱一般采用改变pH值的方法特点特点成本较低，步骤较简单。抗体回收率较高。抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适合于各种标记。纯化后抗体体积大，需要浓缩。需要冷柜，自动收集器。凝胶过滤法(分子筛)l原理原理将样品混合物通过一

14、定孔径的凝胶介质,由于流经路径的差异,使不同分子质量的组分分离.大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小 分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD)n特点特点成本高，步骤较简单。抗体回收率较高，分离条件缓和，抗体活性不受影响。抗体纯度较高。需要自动收集器。纯化方法选择原则纯化方法选择原则l不需要纯化则不纯化；（具体应用）l依据后续实验需求及实验室条件。腹水效价测定腹水效价测定l用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，腹水效价在10-5-10-7之间的可用于实际应用。单抗与多抗比较单抗与多抗比较 单抗 多抗抗体组成 单一 复杂 抗体性质

15、 个体的属性 群体综合的性质纯化标记 容易，效果好 难度高一些 种属来源 绝大多数是小鼠 兔、羊、豚鼠等制备周期 长(最短4个月）短（2个月）制备技术 复杂 简单经费 多 少 l酶联免疫吸附试验（ELISA）l蛋白免疫印迹（Western blot）l免疫荧光技术（IF）l免疫共沉淀（Co-IP)l染色质免疫共沉淀（Ch-IP)ELISA基本原理基本原理l酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留

16、酶的活性。l在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。lELISAELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：三个必要的试剂：（1 1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即“免疫

17、吸附剂免疫吸附剂（immunosorbentimmunosorbent）；）；（2 2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物结合物”（conjugateconjugate）；）；（3 3）酶反应的底物。）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。常用常用ELISA方法方法l1）直接ELISA：待测抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特异性的酶-特异性抗体偶联物。因为所用的酶已经标记在特定的抗体上，可检测的病毒种类只能局限于某一种。l2）间接ELISA：先用抗原包被微量滴定板，然后加入待测抗体，再加入酶标抗体。与直接ELISA相比，间

18、接ELISA适用的范围更为广泛，并且特异性也较好。l3）夹心ELISA：使用俘获抗体（包括单抗和多抗）包被微量滴定板，其余步骤同间接ELISA。根据包被抗体种类的不同，又可以分为同种单抗夹心ELISA，异种单抗夹心ELISA，多种单抗混合夹心ELISA和多抗夹心ELISA等几种方法。与间接ELISA相比，夹心ELISA多了一步以抗体俘获富集抗原的过程，因而其灵敏度和特异性也相应提高。但是对有些病毒的株系，夹心ELISA并不是很好的选择。这可能与单克隆抗体识别的是蛋白亚基的抗原表位还是病毒粒子表面的抗原表位有关基本步骤基本步骤l包被l封闭l孵育l洗涤l显色l结果测定基本步骤基本步骤l包被：包被：

19、l将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)(coating)。l 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。不易吸附不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。

20、抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNADNA，这种包被方法均匀、牢固，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。优点：

21、试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。l包被条件：包被条件：包被液：pH9.6碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液、pH7-8的Tris-HCL缓冲液。l加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。l包被缓冲液的选择要依靠你所包被的物质而定，没有绝对的选择，但有一个原则就是要尽可能

22、的保持包被物的活性不被损失。目前常用的包被缓冲液有PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液等，一般来说，缓冲液的pH要大于蛋白质的pI，以保持其活性。l碱性包被液如碳酸缓冲液用的较多，尤其是在小分子和载体蛋白的偶联物的包被，其主要的优势在于碱性环境可以使蛋白更容易与板子结合。也有用PBS和柠檬酸缓的，但是比较少见。l洗涤：洗涤：lELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。常用的洗涤液为含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液，洗涤3次，5 min/次。l清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的

23、干扰物质洗涤下来。l可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。l封闭：封闭：l封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而避免ELISA后续步骤中抗原或抗体与固相载体的直接吸附。l常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。l 所有的ELISA固相均需封闭。l孵育：孵育：l抗原抗体完成反应的保温过程称为孵育，通常37孵育0.5-1 h。l应注意孵育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。l显色：显

24、色：l于各反应孔加入临时配制的TMB底物溶液0.1 ml，37反应10-30 min。l显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。l结果测定：结果测定：l于各反应孔加入2M硫酸0.05 ml，终止反应；拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。于450 nm处，以空白孔调零后测定各孔OD值。l结果判定：结果判定：l目测定性法：加入底物经酶解和终止反应后，肉眼观察阳性孔颜色明显深于(竞争法则浅于)阴性对照；与阴性对照的颜色接近者，判定为阴性。l以P/N

25、值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性；P/N值小于2.1，但大于1.5为可疑；P/N小于1.5为阴性。对照设定对照设定l阳性对照和阴性对照是检验试验有效性的控制品，同时也是作为判断结果的对照。l阳性对照的基本组成应尽量与检测标本的组成一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。l阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。l参考标准品：定量测定应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度。ELISA的应用的应用lELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。l检查抗原和半抗原方面

26、：在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，其敏感性与RIA相当，在血液学方面可用于检查凝固因子（如第凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等，在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）。l检查抗体方面：用ELISA间接法检查抗体，已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断；在免疫性疾病方面有试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原

27、的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等；在卫生学方面，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。免疫印迹（免疫印迹（western blot）印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNADNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的

28、印迹分析称为Eastern印迹法。埃德温迈勒萨瑟恩（Edwin Mellor Southern）基本原理基本原理应用范围应用范围l检测组织、细胞中蛋白的表达情况（定性、半定量）6.最后加上相应的底物溶液，当二抗上的酶催化底物产生化学发光时,用X光片曝光，洗片后就会产生可见的区带，指示目的蛋白质的位置和强弱。3.通过电泳将蛋白样品分开。5.印迹首先用封闭液（如5的脱脂奶粉）处理以封闭固相载体上剩余的疏水结合位点，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印迹中只有目的蛋白质与一抗特异性结合。洗去游离的一抗后，用再与酶标记的二抗孵育4.将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持体.转移后的硝酸纤维素膜就称

29、为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。1.提取细胞或组织蛋白，测定总蛋白浓度2.测定总蛋白浓度，并处理样品基本步骤基本步骤细胞总蛋白的提取细胞总蛋白的提取l提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很多，鉴于后续实验对蛋白性质的要求不同，因此很难找到一种万能的裂解方法。n 不论采用那种方法，都应遵循以下原则：1尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。2细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂的种类很多，要根据具体情况具体选择。本实验中选用PMSF(苯甲基磺酰氟)作为蛋白酶抑制剂。3样品裂解

30、液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80。切勿反复冻融已制备好的样品。BRIPA buffer：Tris-HCl 50 mM,pH 7.4 NP-40 1%去氧胆酸钠 0.25%NaCl 150 mM EDTA 1 mM 目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续实验的需求目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续实验的需求A细胞总蛋白裂解缓冲液(100 ml)：1 PBS 80ml Tritonx-100 1ml 去氧胆酸钠 0.5g SDS 0.1g 补1PBS缓冲液至100ml.注意事项：注意事项：1.注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进有致命危险。一旦眼

31、睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗。2.所用离心机需提前预冷。3.为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。4.吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。n Western Blot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须尽量使各组 之间总蛋白量基本一致;n 蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定;蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力基于以上两方面原因，在进行蛋白电泳之前，先要对提取的总蛋白进行含量测定基于以上两方面原因，在进行蛋白电泳之前，先要对提取的总蛋白进行含量测定蛋白定量蛋白定量l目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩尿法（Biuret法）、Folin酚试剂法（L

32、owry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。蛋白定量方法蛋白定量方法SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳lSDS 是一种离子性的表面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链。l当 SDS 与蛋白质混合时

33、，它会以其碳链与蛋白质的疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以磺酸根离子外露与水分子作用。大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例的SDS 后，由于 SDS 带强负电荷，使蛋白质原先所带电荷显得微不足道,且每单位重量的蛋白质所带电荷一致，所以不同蛋白质的迁移率大小就主要由蛋白分子大小这一主要因素决定。SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度(%)线性分离范围KDa 15 10-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212l1.丙烯酰胺和双

34、丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴手套及口罩 l2.过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制 l3.溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃夹槽中 l4.为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的4蛋白质电泳上样缓冲液 l5.正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由上向下方向电泳 l6.电泳尽量在4冰箱中进行注意事项：注意事项：转膜转膜l凝胶电泳结束后，将凝胶上分离的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。l选择膜的主要根据有：1.膜与目的蛋白分

35、子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量）2.膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）3.不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显色方法，信噪比好）4.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜-滤纸滤纸凝胶凝胶膜膜滤纸滤纸+l1.转膜液最好现配现用l2.检查样品凝胶是否与转移槽的“-”侧保持一致，以确保样品蛋白由凝胶转移至膜上。l3.NC膜应小心操作，防止破裂注意事项：注意事项：l转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增强化学发光）发光或DAB（3,3二氨基联苯胺）显色技术检测目的蛋白。n ECL ECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗

36、上标记试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗上标记 的辣根过的辣根过氧化物酶氧化物酶(HRP)(HRP)，使底物发生氧化还原反应，从而产生化学。，使底物发生氧化还原反应，从而产生化学。固相免疫检测固相免疫检测lDAB显色原理：DAB在HRP作用下形成红褐色不溶产物，从而指示目的蛋白位置及强弱。lECL发光相对于DAB显色而言，具有发光持久，灵敏度高(一般可达到pg级以上)等优点，且DAB具有致癌性。l应用化学发光，膜可以再生检测其他蛋白。l1.处理膜的过程中，切勿使膜干掉（否则导致背景增高）l2.选择合适的一抗及二抗浓度（浓度高不一定效果好，过高会导致背景变黑）l3.选择合适的封闭液（如果膜需要

37、再生，最好选用脱脂奶粉，而非BSA）l4.应考虑试剂的发光强度及其衰灭时间，来选择合适的曝光时间注意事项：注意事项：一、膜上没有信号答：原因有很多：1 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；2 细胞中的蛋白质被降解掉了，必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，并且提取过程冰上操作；3 转膜过程出现失误；4 抗体或酶失活，选择在有效期内的试剂；5 抗体不能识别目的蛋白，多看看说明，看该抗体是否适用于western。结果分析结果分析二、目的带很弱答：1 标本中靶蛋白含量低，可以加大样品的上样量。2 转膜不充分，可以通过提高转膜电流或延长转膜时间来解决。3 抗体效价低，可以减少抗体的稀释倍

38、数，增加抗体浓度。三、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：1 膜没有均匀浸湿，PVDF膜转膜前应该用100%甲醇将膜完全浸湿10秒，快速激活；2 膜或者缓冲液污染，拿取膜与吸水纸时要戴手套，及时更换新鲜转膜缓冲液；3 封闭不充分，延长封闭时间；4抗体与封闭剂出现交叉反应，检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应，如果有，考虑更换封闭液；5抗体浓度过高，增加抗体稀释倍数四、条带中出现单个或多个白点？答：膜和胶块存在气泡，转膜时赶尽膜和胶块之间的气泡五、制备的凝胶不平？答：胶板洗刷干净，加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀，温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀，室温较高时，操作应迅速。六

39、、用于westernwestern的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？答：一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。七、检测到的抗原分子量是资料上的两倍，是怎么回事？答：抗原形成了二聚体。增多-巯基乙醇的量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。八、做westernwestern必须要内参吗？答：内参起着校正总蛋白上样量的重要作用，只有在内参条带基本均匀一致的情况下，目的蛋白条带出现的差异才有意义,表明的确是实验设计的干预因素造成目的蛋白量的变化，而不是加

40、样误差造成目的条带含量的变化.所以内参是必须做的。内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。内参名称分子量大小适用范围Tubulin55kD胞浆和全细胞VCDA1/Porin31kD线粒体COXIV16kD线粒体Lamin B166kD细胞核TBP38kD细胞核八、非特异条带多答：1 抗体特异性不够，考虑使用单抗，保证抗体的特异性；2 蛋白降解，应尽量使用新鲜制备的样品，提取后一定要分装，避免反复冻融。九、曝光后出现反像答：HRP含量过高导致，建议降低二抗

41、的使用浓度免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescence，IF）l定义：定义：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。l原理：原理：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。3T3 LinePtK1 LineNBL-6 LineR

42、K13 LineLongitudinal FissureBlood VesselsCerebellum定位定位直接法：荧光素标记的特异性抗直接法：荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。体直接与相应抗原反应。间接法：特异性抗体与相应抗间接法：特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。再与第一抗体结合。分类分类实验方法实验方法l将培养好的贴壁细胞用PBS轻轻漂洗2次(PBS提前置室温)，避免细胞脱落；l4%多聚甲醛室温固定30min(静置)；lPBS涮洗3次，然后摇床缓慢摇洗5min3次；l0.5%Triton-100室温缓慢摇30min，涮洗3次

43、；l用与二抗同源的血清（10%），室温缓慢摇晃封闭1h，置湿盒内；l用烧杯装PBS，涮洗玻片一次；l用纸将PBS吸干后，滴加一抗（约100 ul），4度过夜，置湿盒中。鼠抗LRP16（1：100），兔抗p65（1：150）；lPBS涮洗次，摇床摇洗10min次；l用纸将PBS洗干后，滴加二抗（羊抗鼠FITC1：200，羊抗兔5941：600）,湿盒，避光！室温h，加二抗以后所有操作均应避光；lDAPI染核min（用PBS按1：2500稀释）；lPBS涮洗次，摇床慢速摇洗10min次；l封片：甘油PBS（1：1），每张片子约需13ul；l共聚焦显微镜观察结果或-20度保存。结果判断结果判断l设立

44、实验对照设立实验对照:阳性对照和阴阳性对照和阴性对照性对照l阳性细胞显色分布阳性细胞显色分布:胞质型、胞质型、胞核型和膜表面型胞核型和膜表面型免疫学三大工具比较免疫学三大工具比较l免疫荧光免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。lELISA（酶联免疫吸附试验）（酶联免疫吸附试验）用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，

45、操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。l免疫组化和elisa所用到的原理 大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度非常高。lwestern bolt 先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。ELISA与与western blot比较比较lwestern blotting 可以看到特异性的条带，但是定量比较麻烦lELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非

46、特异性结合，那得到的数值就不可信；lWB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到；lWB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测；lWB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而ELISA无能为力；lWB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。ELISA一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度；免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-IP)l用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白

47、质之间相互特异性结合。染色质免疫共沉淀（染色质免疫共沉淀（Ch-IP)l染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay,Ch-IP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。购买抗体时要注意厂商的标注购买抗体时要注意厂商的标注适合于做什么实验适合于做什么实验,使用浓度多少使用浓度多少WB（Western blotting，免疫印迹)IH(Immunohistochemistry,免疫组织化学)IC(Immunocytochemistry,免疫细胞化学)IEM(Immune lectron microscopy,免疫电镜)FCM(Flow Cytometry,流式细胞仪)ELISA(enzyme linked immunosorbent assey,酶联免疫吸附实验,酶联免疫分析)举例举例复习思考题复习思考题l简述IF、western blot、ELISA的在应用中的区别。