细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项

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1、概述冷冻保存与复苏的原理冷冻速率冷冻保存温度复温速率冷冻保护剂冷冻保存方法非玻璃化冻存方法主要材料冻存过程冻存结果讨论玻璃化冻存方法主要材料培养细胞的冷冻保存与复苏欧阳学文冻存过程冻存结果讨论冻存细胞的复苏非玻璃化冻存细胞的复苏主要材料复苏过程结果讨论玻璃化冻存细胞的复苏主要材料复苏过程结果讨论Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具 有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够 大大提高贮存于790C下精子的存活率。接下来的重大进展 是Luyet （1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了 电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是，电解质 浓度增大

2、是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得 到 Merryman（1956）、Rey （1957）以及 Smith（1961）等学者的继续和发展。1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘 油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油 作为保护剂。Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保 护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。而且，用 于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存 理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保 存与复苏技术都已十分成熟和完备。返回页首冷冻保存与复苏原理在低于700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化 反

3、应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。 如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水 分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而 引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为 细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的 降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液 中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中 且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗 漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死 亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为 溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结 冰，产生冰

4、晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则 可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易 同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成， 并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细 胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏 时，一般以很快的速度升温，12分钟内即恢复到常温，细胞 内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解 质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻 存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率 有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。返回页首冷冻速率冷冻速

5、率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞 在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至50C时，因溶 液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未 结冰；当被冷至5150C之间时，细胞外溶液先出现结冰而 细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞 外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是， 细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向 细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也 不相同：如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水， 体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如 果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着 温度的下降而

6、发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超 快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃 状态(玻璃化冷冻)。Luyet (1973)证实液体的凝固可分 为两种形式：一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另 一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保 持未凝固前的状态。不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化， 也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱 水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。 同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使 细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷 冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较多冰

7、晶， 造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。超快速 玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内 外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜 和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时 间暴露而受损。不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵 母、人红细胞的最适冷冻速率分别为160C/min、 70C/min和2000C/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率 可在1.60C3000C/min，故对一种细胞进行冷冻保存之 前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻 存活率。返回页首冷冻保存温度冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温 度下

8、，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存， 在复苏后仍能保持正常的结构和功能。不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取 得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同。但从实际 和效益的观点出发，液氮温度（1960C）是目前最佳的冷冻 保存温度。在1960C时，细胞的生命活动几乎完全停止，但 复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生 物样品在1960C下均可保存十年以上。应用700C800C 保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时 间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到400C范围内保存 细胞的效果不佳。返回页首复苏速率冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻

9、速率、合适 的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温 速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率 不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说，复温速度越快越 好。常规的做法是，在370C水浴中，于12分钟内完成复 苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细 胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间 内发生。返回页首冷冻保护剂冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷 冻保护剂常常配制成一定的溶液。一般来讲，只有红细胞、 大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻 保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的

10、冷冻速率冷冻， 可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来 说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也 不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻 保护剂的平衡盐溶液中，并以036000C/min的冷冻速率 降温冷冻，98%以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂 进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻 保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包 括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保 护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在 细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中

11、 电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同 时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱 缩。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保 护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分 渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在40C时，其 毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所 以，冻存时DMSO平衡多在40C下进行，一般需要40 60分钟。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分 子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙

12、二 醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说 很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可 以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使 冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶 液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多采用 联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。由于许多冷冻保 护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细 胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。返回页首冷冻保存方法按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方 法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用 各种温级的冰箱

13、分阶段降温至700C800C，然后直接投入 液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下， 再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或 多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度 的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞， 直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液 没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方 法。返回页首非玻璃化冻存方法下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍非玻璃化冻存 细胞的详细过程。返回页首主要材料(1) 仪器设备：普通冰箱、300C低温冰箱和700C 800C超

14、低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机 程控降温仪等；(2) 冻存管：容量为1ml或15ml;(3) 冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液 与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱 冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解；(4) 待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。返回页首操作过程1. 待冻存细胞悬液的制备(1) 按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制 备单细胞悬液，并计算细胞总数；(2) 将细胞悬液以8001000r/min离心5min，去上 清夜；(3) 向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀， 使细胞密度达1X1061X107个/ml;(4) 按

15、每管115ml的量分装于冻存管内，拧紧管 盖；(5) 再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。2. 分级冷冻(1) 先将冻存管放入普通冰箱冷藏室(480C)，约 40min；(2) 接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室(100C 200C)，约 3060min;(3) 将冻存管转入低温冰箱(300C)，放置30min左 右；(4) 然后将冻存管转移到超低温冰箱(700C800C)，过夜；(5) 最后将冻存管投入液氮保存。3, 记录做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。返回页首冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。返回页首讨论

16、在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就 有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最 好带手套。在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免 液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。 操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具 有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存 价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏12管， 以观察其活力以及是否受到微生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在 复苏时，需要从1960C的液氮中

17、取出冻存管，立即投入 37400C温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生 危险。返回页首玻璃化冻存方法以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法 （Takhashi et al. 1986 ）。返回页首主要材料（1）冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入 20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二 醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH调节pH至7.4，现配现用。（2）冻存管：SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径 4.5mm；（3）设备：液氮储存罐；（4）待冻存细胞：人类外周血单核细胞。返回页首冻存过程(1) 用常规方法

18、分离全血中单核细胞；(2) 在冰浴中预冷冷冻保护液；(3) 将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内 (冰浴)；(4) 沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程 为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以 0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min 速度滴加2X107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加 的时间在15min左右。最终细胞密度要在1X106 1.5X106个细胞/ml,边滴加边轻轻晃动离心管；(5) 轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；(6) 将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存 管装08ml细胞冷冻悬液；(7) 将冻存管两端以火焰封口；(8

19、) 最后将冻存管直接投入液氮中保存。降温速度约为 6000C/min。返回页首冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。返回页首讨论玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要 复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。目前，该方 法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞 的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复 苏后较烦琐的操作有关。因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室 温下对细胞具有毒性(但在40C时毒性大为减弱)。所以， 冷冻保护液的滴加全过程必须在40C冰浴中进行。另外，滴 加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的 渗透压，造

20、成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴 加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细 胞内外的平衡。返回页首冻存细胞的复苏非玻璃化冻存的复苏方法返回页首主要材料（1）仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；（2）培养用液：完全培养液。返回页首复苏过程(1) 调配370C400C的温水，或将恒温水浴箱的 温度调节至370C400C;(2) 从液氮中取出冻存管，立即投入370C400C 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；(3) 将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培 养液，轻轻吹打混匀；(4) 将细胞悬液经8001000r/min离心5min，弃 上清夜；(5) 向细胞沉淀内加入完全培

21、养液，轻轻吹打混匀， 将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。返回页首结果复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达 90%以上。讨论细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液， 防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程 中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。返回页首玻璃化冻存的复苏方法以下以人的单核细胞为例说明其过程（Takhashi et al. 1986）。返回页首主要材料（1）设备：高速离心机；（2）培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶 液、培养液。返回页首操作过程将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。

22、一次可以进行多个冻存管的 复苏；(2)将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50m】离心管中；沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min 的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入， 接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后 30min以1ml/min的速度加入。全过程约为 65min，都在冰浴中进行；将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于 培养。结果复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达 90%以上。返回页首讨论复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保 护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进 行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也 要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗 出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。