季节变化对青海沙蜥成体神经发生影响的【推荐论文】

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1、精品论文季节变化对青海沙蜥成体神经发生影响的研究郭萍敬1，徐鑫佳1，郑雪1，范力1，刘兵峰1，许文强1，王建林1，赵善廷25（1. 兰州大学生命科学学院，兰州 730000；2. 西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100） 摘要：目的：探索和研究季节变化对我国青藏高原特有物种青海沙蜥成体神经发生的影响并 分析其相应机制，重点关注了冬眠对青海沙蜥成体神经发生的影响。方法：5、7、9 月于青10海省海西蒙古族藏族自治州境南部的格尔木盆地采集青海沙蜥，各分为三组，分别存活 24小时，7 天，以及 28 天，其中 9 月采集的部分沙蜥于实验室中进行冬眠研究。运用 BrdU 腹 腔注射，DAB 免

2、疫组化显色，激光共聚焦显微镜拍照等实验手段分析和研究不同季节青海沙蜥成体神经发生的特点。结果：青海沙蜥的成体神经发生呈现出明显的季节特性，其成体神经发生强弱的总趋势为秋季夏季春季冬季，冬眠条件下青海沙蜥仍有成体神经发15生，但较为微弱。各季节中不同存活时间的横向比较也出现了明显的差异。 关键词：青海沙蜥； 成体神经发生； 免疫组化； 细胞增殖； 季节 中图分类号：Q95Study on adult neurogenesis in the Phrynocephalus20przewalskii during different seasonsGUO Pingjing1, XU Xinjia1,

3、ZHENG Xue1, FAN Li1, LIU Bingfeng1, XU Wenqiang1, WANG Janlin1, ZHAO Shanting2(1. School of Life Science,Lanzhou University,Lanzhou 730000;2. College of Veterinary Medicine,Northwest A&F Universities,Yangling 712100)25Abstract: Objective: The aim of present study is to investigate the seasonal influ

4、ence on the adult neurogenesis in Phrynocephalus przewalskii - typical reptile in northwest of China, and analyze the corresponding mechanism. Among the total, adult neurogenesis in the Phrynocephalus przewalskii during hibernation was the key point we focus on. Methods: Lizards were captured during

5、 Match, July and September, respectively. According to surviving time the animals were30divided into three groups: survivied 24 hours group, 7 days group, and 28 days group. The lizards that captured in September were used for the study of hibernation. Intraperitonial BrdU-injection, Immunocytochemi

6、stry and laser scanning confocal microscope were used to study the adult neurogenesis in the Phrynocephalus przewalskii during different seasons. Results: The adult neurogenesis is regulated in a seasonal way in the Phrynocephalus przewalskii obviously. While35Autumn has the strongest adult neurogen

7、esis, followed by Summer, Spring, and Winter. Duringthe hibernation, adult neurogenesis still existence in the Phrynocephalus przewalskii, but was weak.In each season, variations was showed in different living time.Key words: Phrynocephalus przewalskii; adult neurogenesis; immunocytochemistry; cell

8、proliferation; season400引言早期的神经生物学相关研究中曾经认为，神经系统一旦成熟便不会产生新生神经元。但 最近的研究显示，成体大脑内新生神经元的的数量可随环境刺激而增加1-3。溴脱氧尿苷 基金项目：国家自然科学基金（31071873）作者简介：郭萍敬（1989-），女，硕士研究生，动物学，成体神经发生，生态神经生物学通信联系人：赵善廷（1964-），男，教授，发育神经生物学，成体神经干细胞，突触可塑性与学习记忆原 理，老年性神经系统疾病，生态神经生物学. E-mail: zhaoshanting- 9 -（BrdU，bromodeoxyuridine）是一种胸苷类似物，

9、在细胞分裂前的 DNA 复制过程中会整合45入 DNA 中，将 BrdUl 注射入动物体内，被标记上 BrdU 的细胞意味着其刚完成有丝分裂， 是一个新生细胞。通过这种技术，人们发现成年动物每天都有成千的新生神经元生成。这表 明大脑即使在出生之后，也不是一个解剖意义上一成不变的组织结构，其伴随着一定程度的 成体神经发生。成体脊椎动物大脑中，成体神经发生是分阶段进行的。新神经元从特定脑区产生，接着50迁移，最终作为成熟神经元汇入神经网络中，期间每个过程均受到不同因素的影响4。这些 因素丰富多样，比如生存环境5、运动练习6-7饮食结构、压力刺激8等等。研究人员推测， 成体神经产生以及存活对环境和特

10、定生理阶段的适应有一定作用。目前哺乳动物及鸣禽的成体神经发生已经研究的较为透彻，而爬行动物中的相关研究还 处于探索阶段。蜥蜴成体神经发生的研究更是鲜见报道，近些年才开始系统的对其神经发生55进行研究9-11。蜥蜴，同鸟类一样，其行为呈现出季节多变性（春季挖洞及约会，夏季产蛋 及孵化等等），已有研究表明鸣禽中成体神经发生受到季节的调控12-16。但在蜥蜴中，这方 面的研究仍处于起步阶段。研究者们曾对绿蜥蜴在不同性别和季节条件下的成体神经发生进 行了探索，发现其成体神经发生具有性别和季节特异性17-18。而最近西班牙学者就蜥蜴品种（Gallotia galloti）进行了成体神经发生方面的研究，也

11、确定该种蜥蜴的成体发生具有季节60特异性19-20。近几年我国学者吴鹏飞等展开了青海沙蜥的行为及发育等方面的研究21-24，但 尚未涉及成体神经发生这一方面。较之 Gallotia galloti 潮湿，四季温度变化幅度较小的温暖 海洋性气候生存环境，青海沙蜥生活的青海高原属高原亚干旱气候，四季分明，温差显著， 冬季寒冷而漫长，那么生活于截然不同的地理条件中的青海沙蜥，其成体神经发生是否同样 呈现出随季节变化的规律？对此，我们将 BrdU 注射和免疫组化等一系列实验方法相结合，65研究了季节变化对青海沙蜥成体神经发生的影响并分析了其相应机制。结果发现青海沙蜥的 成体神经发生呈现出明显的季节特性

12、，其成体神经发生强弱的总趋势为秋季夏季春季冬季，冬眠条件下青海沙蜥仍有成体神经发生，但较为微弱。各季节中不同存活时间的横向 比较也存在着明显差异。1 材料和方法701.1 实验动物采集及分组青海沙蜥分别于 2011 年 5、7、9 月份采集于青海省海西蒙古族藏族自治州境南部的格 尔木盆地。捕获后随即对其吻肛长及体重进行了测量，筛选出大小及体重相似的成年雄性沙 蜥（SVL 为 5.650.24 cm，体重为 7.681.21 g ）作为实验对象。在捕获动物后立即按 50mg/Kg 体重进行腹内腔注射 BrdU，每隔 12 小时注射 1 次，连续注射 3 天，然后将各季节捕获的沙75蜥分成 A、B

13、、C 三小组各 8 只，其中 A 组在最后一次注射 BrdU24 小时后处死；B 组注射 BrdU 后继续生存 7 天；C 组注射 BrdU 后继续生存 28 天。断首处死后，头部于 4%多聚甲 醛中固定三天后于体式显微镜下取脑，于 4保存于 4%多聚甲醛中。1.2 冬眠组处理在 9 月份采集的沙蜥中随机挑选出 40 只，作为冬眠组。首先进行冬眠前的适应处理：80将沙蜥放入纸箱（底部覆盖一厚层树叶，侧壁和顶端开通气孔）中，于定时通风的冰箱中放 置。在 2015 10 5 4的四个温度梯度各保持 1 天，而后在 4中维持 15 天，确保沙蜥顺利进入冬眠后展开冬眠组的实验。分为三组，注射 BrdU

14、 后分别存活 24 小859095100105110115时，7 天，28 天，断首处死。头部于 4%多聚甲醛中固定三天后于体式显微镜下取脑，于 4保存于 4%多聚甲醛中。1.3 BrdU 注射及切片采集到沙蜥后随即在当地腹腔注射 BrdU（溴脱氧尿嘧啶核苷，bromodeoxyuridine，80 50mg/Kg，购于 sigma 公司），每天每只沙蜴注射两次（间隔 12 小时），共注射三天。 注射最后一次 BrdU24 小时/7 天/28 天后麻醉致死，完整取脑后经由 4%多聚甲醛固定 3-5 天， 而后分别用震荡切片机（50m）以及冰冻切片机（20m）进行冠状连续切片，收集在盛有0.1M

15、PB 的 24 孔培养板内于-4冰箱中保存。1.4 免疫组织化学染色从切片中挑取前嗅核（anterior olfactory nucleus; AON）部分进行 BrdU-DAB 免疫组织 化学染色。切片首先在蒸馏水中缓冲处理 10 分钟，而后在 3%的 H2O2 中放置 30 分钟以阻断内源 性过氧化物酶。随后于 0.1MPB 中漂洗 15 分钟，重复 3 次，再经蒸馏水漂洗 10min。而后 于 37在 2M 的 HCl 中酸化 30 分钟，再经 0.1 M 硼酸缓冲液（pH 8.5）漂洗 15 分钟，重 复 3 次。之后加入一抗：rat anti-BrdU (1 : 500, Serot

16、ec, Germany)，4摇床上孵育过夜。0.1 M PB 漂洗后加入二抗：rabbit anti-rat-biotin，4摇床上孵育过夜。0.1 M PB 漂洗后加入Elite-ABC(1 :0, vector, USA) 于室温摇床中孵育 2 小时，经 0.1 M PB 漂洗后，再于 DAB（二 氨基联苯胺，diaminobenzidine）室温下孵育 10 分钟，随后加入 0.3%的 H2O2 显色 35 分钟。 最后，经 0.1 M PB 漂洗后进行梯度酒精脱水，中性树胶封片。1.5 细胞观察及计数在 OLYMPUS 光学显微镜下观察染色情况并拍照。记录被 BrdU 标记的细胞的分布

17、位置， 数量，以及形状，以便分析研究青海沙蜥的成体神经发生情况。用 Image J 软件测量出切片 中各脑区对应的脑室壁周长，再乘以切片厚度（20m），即可得到各脑区室壁单位面积内 新生细胞的数目。1.6 统计学分析采用 SPSS 17.0 及 Orgin7.0 软件对实验数据进行统计学处理。组间比较通过单因素方差 进行分析（ANOVA）。P 0.05 则表明差异具有统计学意义。2 结果2.1 青海沙蜥脑室区 Brdu-DAB 染色结果之前的研究已经证实，在注射 BrdU 之后，青海沙蜥脑组织中的 Brdu-DAB 阳性细胞多 集中于端脑，其中以前嗅核（anterior olfactory n

18、ucleus; AON）区域能够观测到的阳性细胞数 最多，即该区域的成体神经发生最为活跃。因而在本研究中为了获得最显著的效果，我们选 取了 AON 区域的脑片作为实验材料，进行免疫组化染色和阳性细胞数的统计。图 1 中分别展示了四个季节 24h 组的青海沙蜥 AON 区域脑室的 Brdu-DAB 染色结果。从图中我们可以看出大部分 Brdu 阳性细胞位于侧脑室壁的亚室带中（subventricular zone）， 在实质中仅有少量分布。被标记的阳性细胞，多呈圆形或是拉长的椭圆形，单个或是成对出 现。各季节被标记的阳性细胞在形态、大小以及分布上没有差异。120125130图 1.各季节青海沙蜥

19、脑片 AON 区域的 BrdU 阳性细胞分布。V：脑室；标尺，50m。Fig. 1 Photographs of BrdU-positive cells in the VZ of the AON during the different seasons.2.2 青海沙蜥成体神经干细胞的增殖具有季节性青海沙蜥的神经干细胞的增殖速率呈现季节性变化，被标记的阳性细胞在统计图中呈钟 形分布（见图 2）。秋季标记的细胞数量最多，夏季其次，相较之下春季标记的细胞数少， 而由于冬眠的缘故冬季的阳性细胞数则几乎减少到零，仅标记到极少量的阳性细胞，这显示 青海沙蜥在冬眠的时候仅有微弱的成体神经发生对应于该阶段青

20、海沙蜥微弱的生理活动。除24 小时组中春季和夏季的阳性细胞数较为接近外，24 小时租中的其余季节及其它组别中的 各季节间阳性细胞数均存在着差异显著，即是说青海沙蜥在各季节成体神经发生水平差异较 大，其成体神经干细胞发生具有显著季节特异性，其中以秋季的成体神经发生最为活跃，冬 季最为微弱。135140145图 2.青海沙蜥不同季节 24h 组（图 A），7d 组（图 B）以及 28d 组（图 C）的每平方毫米脑区阳性细胞数（各季节每组的样本数为 n=8）。Fig.2 Distribution of labelled cells per mm2 (meanS.E.M.) in 24h(A), 7d

21、(B) and 28d(C) groups (n=8 for each group and season) during the different seasons.秋季组被标记的阳性细胞数最多，冬季组的最少。图中“*”表示差异显著（p0.05），“*”表示差异极为显著（p0.01），“n.s.”代表无显著差异。2.3 青海沙蜥成体神经干细胞的存活情况我们分别对各个季节青海沙蜥注射 BrdU 后存活 24 小时，7 天，28 天的情况下，成体 神经的存活情况进行了研究。由图 3 可见，存活 7 天的时候观察到的阳性细胞数最多，表明 该时期青海沙蜥的成体神经发生最活跃，且其成体神经发生水平和 2

22、4 小时及 28 天组差异显 著，出现了一个小高峰。而在 24 小时和 28 天组中统计到的阳性细胞数较为接近，这表明这 两个时间段青海沙蜥的成体神经发生程度也较为接近。青海沙蜥在各个季节中不同存活时间 的成体神经发生均符合这个趋势，显示出一定的稳定性。150155图 3.青海沙蜥春季（图 A），夏季（图 B），秋季（图 C）以及冬季（图 D）24h 组，7d 组和 28d 组的每平方毫米脑区阳性细胞数（组的样本数为 n=8）。160Fig.3 Distribution of labelled cells per mm2 (meanS.E.M.) in 24h, 7d and 28d grou

23、ps (n=8 for each group and season) during spring (A), summer (B) ,fall (C), and winter (D).其中 7d 组被标记的阳性细胞数最多，24h 及 28d 组的阳性细胞数较为接近无显著差异。图中“*”表示差异显著（p0.05），“*”表示差异极为显著（p0.01），“n.s.”代表无显著差异。1651701751803 讨论动物的生长发育与四季气候的变化有密切关系，气候变化影响着动物的生存方式与生存 数量。四季交替，环境的温度、湿度、植被等都会随之发生一定的变化，为了适应这些变化， 动物需要调整自身的行为甚至是

24、生理机制来维持和延续生命。而这些随季节的变化而做出的 改变就是所谓的季节特异性。近些年来研究者们已经证实季节变化能够在多个方面对动物的 生理及行为产生不可忽视的影响，对爬行动物在季节相关方面的研究也有一定的展开。我国 学者近年来对爬行动物的某些生理现象如繁殖，血糖浓度，内分泌等进行了探究，发现其随 季节的变化呈现一定的规律25-27。而我们所关注的成体神经发生反面青海沙蜥的研究还处于 空白期，根据其他蜥蜴品种的研究结果和查阅相关书籍资料我们推测青海沙蜥的成体神经发 生也具有一定的季节特异性，而随后的实验证实了这个推论。青海沙蜥的神经干细胞的增殖速率呈现季节性变化的原因，我们推测与青海沙蜥的习性

25、 以及所处的地域环境有很大的相关性。沙蜥采集区格尔木辖区，属大陆高原气候，少雨、多 风、干旱，冬季漫长寒冷，夏季凉爽短促，降雨量年平均仅 41.5 毫米，蒸发量却高达 3000 毫米以上。日照时间长，年平均高达 3358 小时，光热资源充足。无论气候还是地理条件都 极具特色，与国外学者们所研究的蜥蜴的生存环境有着巨大的差异，而蜥蜴冬眠时期的成体 神经发生还尚未见报道，这正是我们感兴趣的地方。就青海沙蜥本身来说，白昼活动，10 月中旬始入冬眠，期间不吃不喝不动。在实验室 模拟其冬眠的自然条件并顺利引导沙蜥进入冬眠后发现，在此期间，青海沙蜥的成体神经发 生极其微弱，新生的神经细胞几乎为零，从神经发

26、育的角度见证了其冬眠期间微弱的生命活 动。不过在此阶段新生的神经元数量虽然大为减少，但其形态、大小以及分布情况都与其他185190195200205季节没有差异。4 月上旬沙蜥出蛰，若天气持续转冷，出现异常则又入休眠状态，由此可推断春季为其从冬眠到正常活动间的过渡期，沙蜥并不活跃，因而虽然较之冬季其神经发生程 度有所提高，但整体发生水平却并不高。夏季处于是青海沙蜥的交配和产卵的时间段中，因 这些特殊的生理活动，沙蜥的成体神经发生必然较为活跃，因而能够观察到的阳性细胞数也 较多。秋季成体神经发生最为显著，甚至超过了夏季，经过分析和参考相关资料我们推测可能 有两方面的原因：一是秋季沙蜥需要为冬眠做

27、准备，进行能量的储备并保持身体的健康强壮， 因而捕食及各种活动的频率增加，而成体神经的发生也会随着生理活动的活跃而增加。二则 是由于格尔木盆地夏季的特殊气候特点，干燥而日照时间较长。夏季睛天，沙蜥常在 9：0014：00 时活动，11：0013：00 时为其活动高峰；阴天外出活动个体较少，且多在 13：00 时前后活动，在其活动时，若受惊扰即迅速逃或钻入附近的洞穴内。就我们采集夏季组 蜥蜴的实际情况而言，只有在晴天的 11:0013：00 时可以捕捉到沙蜥，其他时间段很少可 以看到沙蜥出没。因而不难理解，为了避免长时间的暴晒于日光下，沙蜥在较为炎热以及阴 天的时候均蛰伏在洞内不活动，一天之中仅

28、有短短的几个小时在外活动，因而其对应的成体 神经发生也不可避免的受到负面影响。由此可见沙蜥夏季时的成体神经发生虽会因为交配而 较春季季增加，但由于受到气候条件的限制，并不如预想中的活跃。综合我们的实验结果， 秋季青海沙蜥的成体神经发生强于夏季，可以认为对青海沙蜥而言，气候条件对其活动的限 制对其成体神经发生带来的负面影响大于交配带来的积极效应。现有研究表明并不是所有新生的细胞都能长期存活，其中有一部分能发育分化成成熟的 神经元并整合到已有的神经网络中，并与其它神经元建立突触联系，而另一部分则在出生后 几个星期内退化死亡。本研究中对不同季节青海沙蜥成体神经发生细胞的存活率进行了研 究，结果显示，

29、各季节均符合 7 天时存活细胞最多，24 小时及 28 天存活细胞数接近。据以 往的研究，成体神经元自产生后会经历增殖和分化再到调亡的过程。那么根据我们的实验，24 小时组对应着青海沙蜥的一批新生的成体神经元，7 天时观察到的阳性细胞数最多则是因 为其较 24 小时和 28 天组更为靠近成体神经元增殖和发育的高峰期，也可能此阶段神经元正 在进行二次分裂。而 28 天时阳性细胞数较之 7 天组的回落则可归结于神经元已经历发育的 高峰开始进行凋亡。根据我们的实验救过可以大体的推测出青海沙蜥成体神经发生循环的周 期和其发育的高峰。但由于爬行动物该方面鲜有报道，蜥蜴的相关资料更是严重缺乏无从参 考比较

30、，因而若要得到准确的结论则还需进一步的实验研究。210参考文献 (References)2152201 Gage FH. Mammalian neural stem cellsJ. Science, 2000, 287(5457): 1433-8.2 Rakic P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidenceJ. Nat Rev Neurosci, 2002,3(1): 65-71.3 Zhao C, Deng W, Gage FH. Mechanisms and functional impl

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