生物化学-蛋白质

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1、氨基酸性质与密码子的关系：9种氨基酸有2个密码子5种氨基酸有4个密码子3种氨基酸有6个密码子1种氨基酸有3个密码子2种氨基酸有1个密码子第二个字母为U的密码子对应的是疏水性氨基酸第二个字母为C的密码子对应的是小或较小氨基酸第二个字母为A或G的密码子对应的是极性氨基酸1.氨基酸个性研究的重要性解释蛋白质结构与功能的关系从一级结构预测高级结构氨基酸个性了解得越深刻，在根据一级结构预测蛋白质的立体结构时，考虑问题也就越全面，预测的正确性也就越高。维持空间构象的因素静电作用、氢键、范德华力、疏水作用、配位键、二硫键及其他因素蛋白质的时空特性（1）蛋白质的空间性信号肽对蛋白质或肽链的定向传送已成为蛋白质

2、研究的一个很重要的方面。特征结构：溶酶体酶分子中的甘露糖-6-磷酸，酶原及酶原激活，同形异位突变（2）蛋白质的时间性肿瘤发生时出现胚胎分化早期所出现的Pr，如肝癌出现的甲胎蛋白。细胞周期不同时期蛋白质表达的调控是又一个重要研究领域。2.分离纯化依据的性质（1）大小（2）性状（3）电荷（4）等电点（5）电荷分布（6）疏水性（7）溶解度（8）密度（9）配体结合能力(10)金属结合能力(11)可逆性缔合(12)特异性序列或结构。(13)非寻常性质(14)基因工程构建的纯化标记3.分离纯化的一般步骤（一）前处理：动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织；种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料

3、种子最好先用低沸 点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。(1)选材 (2)破碎 (3)混合物的分离（二）粗分级分离（1）盐析。（2）等电点沉淀。（3）有机溶剂分级分离。（4）超滤。（5）凝胶过滤。（6)冷冻干燥（三）细分级分离一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一 般规模较小，但分辨率很高。结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶

4、液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。4.依据分子大小、电荷不同的纯化方法一、根据分子大小不同的纯化方法(1)透析和超滤透析 只用于除盐类和小分子杂质透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质 ，使蛋白质和其它小分子物 质如无机盐单糖等分开。超滤 除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质(2)密度梯度离心法生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快

5、，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。(3)凝胶层析是分子大小分离pr混合物的有效方法二、根据电荷不同的纯化方法(1)电泳：不同的pr分子由于其净电荷量和分子大小的不同，在相同条件下电泳，泳动速度不同，彼此得到分离。由于pr具有两性电离性质，当pr溶液pH值大于等电点时，该pr带负电荷，在电场中向正极移动，反之则带正电荷，在电场中向负极移动，只有pr溶液的pH值在pr等电点时静电荷为零，在电场中才不向任何一极移动。(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳（3）毛细管电泳（4）等

6、电聚焦：在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。（5）聚焦层析：该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上

7、时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。（6） 离子交换层析：离子交换柱层析是一种利用离子交换树脂作为介质，即离子交换剂的层析法。离子交换树脂是人工合成的，具有酸性基团或碱性基团，并具有网状结构的高聚物。阳离子交换树脂含有酸性基团，阴离子交换树脂含有碱性基团。由于pr具有两性电离性质，当pr溶液pH值大于等电点时，该pr带负电荷，可结合于阴离子交换剂上；

8、当pr溶液pH值小于等电点时，该pr带正电荷，可结合于阳离子交换剂上。即使带相同电荷的pr分子，由于所带电荷量不同，与离子交换剂的亲和力也不同，利用这种差异可以分离pr复合物。5.结构与功能的关系（一级结构：细胞色素镰刀型细胞贫血症;高级结构：血红蛋白，肌红蛋白）由于血红蛋白亚基之间存在大量离子键，使其构象呈紧张态，对氧的亲和力很低，第一个亚基与O2结合时，离子键的破坏较难，所需要的能量较多。 当血红蛋白的一个亚基结合氧之后引起它的构象从紧张态（T）变成松弛态（R），其它的离子键也依次破坏，此时破坏离子键所需要的能量也少，构象的变化导致血红蛋白对氧的亲和力大大增强，因此第四个亚基结合氧的能力比

9、第一个大几百倍。上述Hb与O2结合后，Hb的构象发生变化，这类变化称为变构效应，即通过构象变化影响蛋白质的功能。像血红蛋白这种具有变构效应的蛋白质称为变构蛋白（allosteric protein）。血红蛋白的这种变构效应能更有效地行使其运氧的生物学功能。在pH相对较低和CO2浓度较高时的外周组织中， 随着H和CO2与血红蛋白的结合，其氧亲和力降低，O2被释放到组织中。相反地，在肺部CO2被排除且血液中pH升高，血红蛋白的氧亲和力增加。在pH相对较低和CO2浓度较高时的外周组织中， 随着H和CO2与血红蛋白的结合，其氧亲和力降低，O2被释放到组织中。相反地，在肺部CO2被排除且血液中pH升高，

10、血红蛋白的氧亲和力增加。血红蛋白每条肽链的氨基端的-氨基与CO2以氨甲酰基团结合形成氨甲酰血红蛋白，该反应产生的H参与波尔效应。结合的氨甲酰也能形成盐桥，有助于T态的稳定且促进释放O2。O2、H+和CO2与血红蛋白结合部位不同(变构效应): O2结合在血红素的Fe原子上；H+结合在蛋白质某些氨基酸残基上；CO2结合在4个亚基的N末端a-氨基,形成氨甲酰。BPG 通过交联脱氧血红蛋白而降低氧的亲和性：Hb四聚体分子只有一个BPG结合部位，位于四聚体中央孔穴内。BPG(甘油酸2,3-二磷酸）结合后，提 供了更多的盐键, 通过与两个链形成交联，稳定T 态构象，即使平衡由松弛型趋于紧张型，促进O2的释

11、放。在R态时O2的结合引起Hb构象变化，中央孔穴变小, BPG被挤出。总之，各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们 特定的生物学功能相适应，蛋白质的 结构与功能是高度统一的。6.亚基与原体以三级结构的球状蛋白质的聚集体形式存在的，通过非共价键彼此 缔合在一起，这样的聚集体称为蛋 白质的四级结构。四级结构的蛋白 质中每个球状蛋白质称为亚基。对称的寡聚蛋白质可视为两个或多个不对称的相同结构成分组成，这种相同结构成分称为原体（protomer）。在同多聚体中原体是亚基，但在杂聚体中原体是两种或多种不同的亚基组成。7.变性后的变化，变性机理及鉴定变性的方法变性蛋白的表现: 生物活性的丧

12、失 侧链基团的暴露物理化学性质的改变: 溶解度.分子形状. 粘度等. 化学性质的改变变性后的蛋白质肽链松 散，内部侧链基团暴露，易于与有关显色试剂 接触，使颜色反应增强。 生物化学性质的改变:易被蛋白酶水解变性机理：温度：温度升高，使分子内振动增强， 破坏维系空间结构的次级键的作用（主要 是氢键），使蛋白质变性。 酸、碱：主要是由于解离基团质子得失后，生成过多正或负电荷，使肽链间静电 斥力增加的结果。有机溶剂A. 由于有较低的介电常数，常使肽链内静电 斥力增加，造成蛋白质分子膨化或松散； B. 在极性较低的有机溶剂环境中，疏水基团 易于从内部向外部转移，使疏水作用力削 弱，促进蛋白质的变性。重

13、金属盐在溶液中加入重金属盐类也会影响蛋白质构 象的稳定性。重金属盐有可能和蛋白质的极 性基团直接作用，使稳定性发生变化，也可 能通过改变溶剂的结构间接影响蛋白质的结 构。鉴定蛋白质变性的方法：测定蛋白质的比活性 测定蛋白质物理化学性质的变化测定蛋白质生物化学性质的变化用免疫法测定蛋白质的抗原性是不是改 变蛋白质的溶解度是不是下降。8.蛋白质组学研究内容及其研究方法9.研究蛋白质相互作用的常用方法酶对生命的作用酶及生物催化剂的概念酶学研究重大进展酶分离纯化酶活力 测定方法 注意事项严格控制实验条件，最适温度、最适pHn ESn 做对照实验n 酶液不宜放置过久n 有些反应不一定在水溶液中进行酶的催化机理及研究方法影响酶促反应速度的因素抑制剂的概念及研究意义多底物反应动力学