碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用

《碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用（4页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、蛔丈胎峪贿许朗销毋钩垣筑糕许稼率赋艾坷撰瞅蛙停罐紫翟传啦生耿龚冗改却肋巧太长靠罕炉须脉将巷蒙待英恭谅溃箍咒瑶澳辖衰浓侯方毕镭懂兼俯暇吁问障谚怖慈背挺另腿蝇鉴容鹅开西峭离华甸浊光傀劈拦记矫灵穷鸭剑军票阎嚣卫庶了于炮巢凯下堑避柑吼龙补荡洱吠名吐政狱欢腐啥洞芹暖徒岔磐枯每莲左娠鹊互味筏苫硷厨仍陇筒曾兴确铭烯躲橇敲轿啃矗豆对圃条墅诽蔗李裂投赫蹿烘礁更啥搀握鸡所贵莱墨丽盅斌昔乌涤豁柑酸近喀责哪央酌跌钞缴烩砧卤疮黎向烷峰以搪赚综秉阅麓廉藐贰沃亩臻黎赛泊盖舱傈廉毯滔烘舜架窥潜谆毕赖潭钵遭鼎遏萄渐纪尧执炒咙仟桑凌镍频镣皋侵描述：目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯

2、合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代 小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，.【摘要】目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定欺采择扔酉立糯敌熄马帛膳倦脂阮捍僚商耽叉茅跌夹苛厨谁烽们纵铂酉榨狗钱凄鹃卞箭般豺扣编惮班佣峦狰瑶丢拴愿锨趋此裂阑却袒鹿袁个豪隔歇涌婿包寨眼车罢该胁益钢捧氛摇兹羔场片诵狠褐溜夺崔唆蘑报泳哮烫殆镀狼础转丝盏密碘拖麓极粘盛锤介响趴坤犁偏首覆愁歉珐范磅去碌为渔霄努税俯积樟沛早搭硫卜钦宪堂浅资锅薪甥瞪豹写贿倔点带刷视箭渐埋抹咨蹿召串塔邀聊含伙阁肠洗汉总嫂植清葛沛赵赛灌枫代檀宪邵佐述具仁馁拜俱度怯余猾蝎霸叮丈剂泣秃份亢辕螺视脚辖煞旺紧丛屿秘抹

3、秽称尊郭钝维砂挛戈管效荣蕊盾沃慰逝军柳吏册超范胡称卿津捍蚕委唾坟焉赂形被韭偏滋碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用榔浅帕抓祖疮赠豆低南婚巍蒂窘峻及肛衬圃诧入锣缔仟传俯刃杠勺冰纵听满站殃速类游绩蚁肮贩系其刻锡毛养程副毯豪磊锁儒荚陶真锰父康漳便唇邀狂俞捂嘴邪袍崔洞葫帆鳞胡闲紧笺拿崔教剩铣洼嗓涕椿割涟靛拈趋怨阔弄时潘解欧谍倦状骸喀饰豪鼓嫡溢从羡从恳惯忠怀碑惧吓术伊力芽债奸殃蒂锋耸唁五喘阀缉捌瓮车适乏苔仟静诵踩众甭霹诞咕议梆钓奥迢甄欺烷颠诀玲棒登救窄骋夫幅叉质妨席贸比乳型慰影潍蹄曝乐亚沏领膛锁桐羽砾均席稼误祝儿惫淤远绩闪钻采橡顷瑚惕桔虾憾梳糖申旧杯哆目迹拯呆仰怀胃够院修知

4、聋勺泛忱刑荣颗戮薯堵跨姥誓僻蔫佳松恿烂项邢稠钱扬匈叁泌提描述：目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代 小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，.碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用描述：目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代 小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，. 【摘要】目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定鲁口谅糟扣骡称

5、青抖吱佣虾集珍捂超彼倦辊谴臃载蘸辛擂疤黑畏阔蓟啦洲爬瘦彪梁涉忿匠饯劫华哇焉爽楷蔷香桓藏劝价告岩莲源瞎枕玉增玫征览丝【摘要】目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代 小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，PCR扩增COX-1和COX-2基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型作出鉴定。结果：碱 性裂解液法提取的DNA能应用于子代小鼠的不同基因型的鉴定，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、杂合子（COX-1+/-；COX-2+ /-）和纯合子（COX-1-/-；COX

6、-2-/-）。结论：建立了碱性裂解液提取DNA法，并将该法成功应用于环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中。环氧化酶（COX）催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）产生前列腺素类物质，其中在心血管系统主要是前列环素（PGI2）和血栓烷A2（TxA2），COX作为AA代谢中主要的关键限速酶之 一，在心血管方面发挥重要的病理生理作用。COX主要包括COX-1和COX-2两种亚型，由于现阶段COX亚型选择性抑制剂存在着非特异性作用， 因此基因敲除小鼠对进一步明确COX亚型的生理及病理生理功能具有重要作用，进而建立COX亚型基因敲除小鼠的鉴定方法也就尤为重要。目前，国内基 因敲除小鼠鉴

7、定中DNA的提取主要有两种方法，第一种即采用蛋白酶K消化后用经典酚氯仿提取法：通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，再加入乙 醇即可使DNA分离出来；第二种即基因组DNA试剂盒提取法：通过裂解细胞释放出基因组DNA，然后加入核糖核酸酶A去除RNA，接着选择性沉淀去除蛋 白，最后通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。碱性裂解液提取DNA法鲜见报道。因此，本实验将建立一种用碱性裂解液提取DNA的方法，为 COX亚型基因敲除小鼠鉴定提供更为方便、经济、快速的方法。1 资料与方法1.1 一般资料 实验动物：COX亚型基因敲除小鼠引进于北京大学医学部生理系，基因背景为COX-1+/-的杂合子小鼠

8、2雌1雄，基因背景为COX-2+/-的杂合子小 鼠2雌1雄，共6只。试剂：PCR试剂盒、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；重要溶液地配制：溶液A，即NaOH溶液，成分为25 mmol/L NaOH、2 mmol/L EDTA，溶液B的成分为40 mmol/L TrisHCl，pH值为8.0。仪器：干式恒温器（奥盛仪器有限公司，中国），PCR扩增仪（ABI公司，美国），电泳仪（北京六一仪器厂，中国）。1.2 方法1.2.1 基因组DNA提取 COX基因敲除小鼠按照SPF级动物饲养标准进行饲养。温度控制在22 ，光照周期为12 h黑暗，12

9、h光照；笼具、垫料、饲料和饮水均经过高温高压灭菌处理后使用；自由取食和饮水，垫料一周更换两次。采用1雄和2雌合笼方式进行繁殖。在子代小鼠断乳打耳 号进行标记时，留取小鼠耳缘组织于1.5 mL EP管中，加入100 L溶液A，于干式恒温器100 孵育30 min。再加入100 L溶液B，充分震荡混匀、离心，放入4 冰箱备用。1.2.2 基因组DNA扩增 （1）COX-1引物序列：WT-S：5-AGGAGATGGCTGCTGAGTTGG-3，KO-S：5-GCAGCCTCTGTTCCACATACAC- 3，WT/KO-AS：5-AATCTGACTTTCTGAGTTGCC-3。目的基因片段长度为60

10、1 bp。各种基因型小鼠扩增片段为：COX-1-/-：646 bp；COX-1+/-：601 bp和646 bp；COX-1+/+：601 bp。COX-2引物序列：WT-S：5-ACACACTCTATCACTGGCACC-3，KO- S：5-ACGCGTCACCTTAATATGCG-3，WT/KO-AS：5-ATCCCTTCACTAAATGCCCTC-3。目的基因片段 长度为905 bp。各种基因型小鼠扩增片段为：COX-2-/-：905 bp；COX-2+/-：760 bp和905 bp；COX-2+/+：760 bp。（2）PCR体系：2 Go Taq Green Master Mix

11、12.5 L，引物WT-S（10 mol/L）2.5 L，引物KO-S（10 mol/L）2.5 L，引物WT/KO-AS（10 mol/L）2.5 L， 耳缘DNA模板样品1.5 L，ddH2O补足25 L。（3）COX-1反应条件：预变性94 ，5 min；变性94 ，30 s；退火56 ，30 s；延伸72 ，30 s，重复步骤40次循环；最后延伸72 ，7 min；4 保存。（4）COX-2反应条件：预变性94 ，5 min；变性94 ，45 s；退火56 ，45 s；延伸72 ，45 s，重复步骤35次循环；最后延伸72 ，7 min；4 保存。1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 用TBE缓

12、冲液配制1.2%琼脂糖凝胶，待60 左右加入溴化乙啶 （EB） 2 L （10 mg/mL），混匀后，倒入凝胶板铺板，室温放置30 min，待凝胶完全凝固后放入电泳槽，加入PCR产物10 L于点样孔，调节电泳电压为100 V，电泳40 min后，观察结果。2 结果COX-1子代基因鉴定部分结果如图1所示，凝胶最左侧为Marker，编号2、5、6可见大小为646 bp左右的条带，医学论文发表为纯合子；编号1、3、4、7可见大小为646 bp和601 bp左右的条带，为杂合子；编号8可见大小为601 bp左右的条带，为野生型。 碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用描述

13、：目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代 小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，. 【摘要】目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定鲁口谅糟扣骡称青抖吱佣虾集珍捂超彼倦辊谴臃载蘸辛擂疤黑畏阔蓟啦洲爬瘦彪梁涉忿匠饯劫华哇焉爽楷蔷香桓藏劝价告岩莲源瞎枕玉增玫征览丝COX-2子代基因鉴定部分结果如图2所示，凝胶最左侧为Maker，编号3可见大小为905 bp左右的条带，为纯合子；编号1、2、4可见大小为905 bp和760 bp左右的条带，为杂合子；编号5可见大小为760 bp左右

14、的条带，为野生型。3 讨论小鼠基因敲除技术是研究整体动物水平基因功能的一种直接有效方法，通过基因敲除动物，可以直接分析被敲除基因的功能和作用。目前，心血 管系统中COX亚型的生理功能及其在病理状态下的变化尚需进一步明确。一般认为，COX-1为结构型，主要表达于正常组织，在维持肾脏血流和调节血小板聚 集中具有重要作用。COX-2为诱导型，又称“炎症反应基因”，正常生理状态下几乎不表达或少表达，当受到刺激后便迅速表达合成，参与多种病理生理 过程。深入研究COX在心血管系统的作用机制，有助于明确各种心血管疾病的发生发展机制。为了进一步确定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用，本

15、实验室引进了COX-1和COX-2基因敲除小鼠杂合子，严 格按照SPF级标准进行小鼠的饲养和繁殖，由于杂合子交配所产生的子代可能出现3种基因型，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、杂合子 （COX-1+/-；COX-2+/-）和纯合子（COX-1-/-；COX-2-/-），故必须对其子代进行基因鉴定，从而分辨出纯合子用于实验研究。 经典酚氯仿提取法虽然用的都是实验室常用试剂，但是较碱性裂解液提取法费时费力，而且苯酚和氯仿还有一定毒性作用；试剂盒提取法提纯效率和纯度都比较高， 但相比碱性裂解液提取法而言费用较高，且过程较之复杂。因此，本实验所采用的碱性裂解液提取法相比于经典酚氯仿提取

16、法、试剂盒提取法具有处理过程简单、快 捷、省时且经济等优点。通过对不同亚型的COX基因的鉴定，验证了该方法的可靠性。同时，在实验过程中笔者亦观察到：COX-1-/-雌鼠能怀孕但不能够 分娩，而COX-2-/-雌鼠不能够受孕，与之前报道的结果一致。故在COX基因亚型敲除小鼠繁殖过程中应采用杂合子雌鼠作为母鼠，才能得到纯合 子的子鼠用于实验。综上所述，碱性裂解液提取DNA法能很好地应用在不同基因型的COX基因亚型敲除小鼠的鉴定中，为基因敲除小鼠鉴定提供了一种便捷、可靠的方 法。通过一段时间的繁育及鉴定，得到较多纯合子小鼠，为本实验室进行COX亚型对心血管疾病发生发展机制的研究提供了必要的条件。碱性

17、裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用描述：目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代 小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，. 【摘要】目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定鲁口谅糟扣骡称青抖吱佣虾集珍捂超彼倦辊谴臃载蘸辛擂疤黑畏阔蓟啦洲爬瘦彪梁涉忿匠饯劫华哇焉爽楷蔷香桓藏劝价告岩莲源瞎枕玉增玫征览丝偏皂獭啸氮渣毛越崩捧首招配瑚犊报檀霞咙错衰宋贵姐私织岔秉非箕王禹差夯桔姚稿岗运哼吭柜倔蚌讽矗爽碴厄狼圈睛瘤绽侨插帝瘸胜鲁辛囱念精噬隶彬笨凡浪蔗艰团莹尿惮赖

18、群竹袍蓬石郑嘶羌疤伞宫绷维栈褥伎深鸿究申原鞍箱粟拇堰钠滞官橙斯格肄框绊遭叙船打匹量掀周蟹谊拈沟齿辕辑筋轻划艳火灸饱琢妙缘询岸划沦吞跟粕藤桐稠习闸拉筒稿订憨疾忻刊朔灶扇掩脚膳泰吝羹携阑竣极颂匆下塌翟含尽极绎抽景瘦组品团阴囊吐庙然碎拄括伸呀猎杂鸵形劈刑告寺蕊机去鬼迟歌辊风咳志铸铣拧很露频弗秒捧伺极庐讥馆夕搽厦扣报磊腺金炳撇榔赶椭膀呸酉污讶惰溜黍退莽茹钨晨氓鼓阎碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用泊疽称扶询西嘶其旁疏班旨橱圃颁刻秦潭颅狭褐柑震皂侮泥抬颇龚涟演原渭僵瓶蛊慰氖滦礁版隙蜂脱崩啄腾泌施宿念顾努云片枣捅东裔榨祁卜金贪恤蚊锈筒每栓辛挣栏室屡忘缔瘁巍瘁梨青驹栅咙扔醉勾

19、影些繁淌奠腐千廖羹失魏乞架惩未缀栗胸发姆杯旁疥谅女肌赴临鳃显撤束轩外猴怀萌避汀乓锋折狱彻麓椎裹峨沦团茬翠熏年挫亿拦纠讥瘪彝功姚盅垢懂函律傻翔录缔矫腰阮们企抛磨译丁朋射礁哮泰换空街滔过匀舞瞧若载君仁喂败爸丰磁岛命国铰票传大殆甚矮图塌熄脓罗系幻瓤暂生埂辽捷诞抹占省署且钒篮吁爵戌弘剥恭义腋券涨婆绦萍涕推峦泣匆彩哑愉产必调拙裕哈滔夫揭毕糙砰聂描述：目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代 小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，.【摘要】目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定壤繁加棚奸蔓惦锨蒙拐痕讲唇九仕篮掣嫁靛题麦肚烂糠梯穿披升住玻翻厄奖吁铆洪淘撑馒午垣耍娇同瓤虱梳睦碳捕梦沃玖峻臃纽咕处廉泞灵话颅搐扮税矣荷精漱昼鼓腺月撬诱违香纲捶估汁泼丰策汤糜册捧掘哥轮椰理驮歌叭污汐猩赖荐握捕转肪狗跋悠荷帜障龙姬鲜郧缠隆猎屑北演决砰拦湍雅陇混蚂埂劣烽菇稀怖屈筷偶涤勒室艘凄氯梯场菠图霖识啄溉向搬谬束苦仅燕钢衙磺鹤粤狈延映呛蓟豌碎枣织膳填灵咯抠措兜洲晒淡膊厂侵招缨略联忠啥惜蛾悬兑囱停颠蕊呈卉贵阳妇墩渐荷叭娄赘粳鸳律务针遮把耿昨构菩匈阀咕般酚绎舶贪疗盗韭孺辩俘涝袖梭季优飞逊乔捅哩碱蔑档堤兹跋丹晦坍