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1、腹水抗体制备(实验室级别)2012-8-27一、实验原理：将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c 小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。二、实验材料：药品：血清培养基、液体石蜡、生理盐水仪器：电热恒温水浴箱、 CO2培养厢、超净工作台、低速自动平衡离心机三、制备步骤：1.打石蜡在细胞培养前两周，取 8 周-10 周的 Balb/C 小鼠，按每个细胞株注射 3 只，1ml/只，以促进小鼠肠道蠕动，进行分笼，写好标记，十天后准备注射细胞；2.杂交瘤细胞复苏与扩大培养(1) 12 孔细胞培养板，每孔中加入的细胞培养液约 2ml。(2) 按冻存细胞的
2、液氮罐位置，取出冻存的细胞管，在 37水浴箱中搅动 1min 左右，快速融化冷冻的杂交瘤细胞。(3) 将融化的细胞吸入 5mL的细胞培养液中，尽量收集细胞，装入 EP管，然后平衡 EP管， 800rpm，8min，进行离心。(4) 将离心好的细胞上清液吸除，吸取 3mL细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞液吸出，按 1ml/ 孔混匀到相应培养板孔中， 显微镜下观察复苏后的细胞数量，生长形态和背景是否有污染及杂质，然后放入细胞培养厢中进行孵育。3.杂交瘤细胞收集与注射(1)待细胞处于对数生长期，即可收集。吸取上清 1ml 后，吹打细胞，使贴壁细胞脱落，然后收集到 15ml 离心管中， 800rpm，
3、 8min 离心，(2) 吸取离心上清液 (冻存备用 )，然后每管加入 4ml 生理盐水，混匀后，同样条件再次离心，弃去上清液，每管再加人 2-3ml 生理盐水，混匀后吸入 5ml 注射器，按约 1ml-0.5ml/只，注射小鼠腹腔。从注射后起一周后，每天注意观察小鼠腹腔隆起程度和小鼠生命状态，防止小鼠死亡。4.腹水收集(1) 取经过免疫的腹部隆起的小鼠，颈部处死，用消毒酒精浸泡，用剪刀剪开腹部上皮，撕开腹部皮肤，挑起腹腔膜，剪开，注意不要全部剪开，将吸管插进去，挤压腹水后，再吸取腹水到 15ml 离心管中， 800rpm，30min 离心，收集油脂层一下淡黄液体，即为腹水抗体。(2) 正常情
4、况下，每只小鼠可收集 2-3ml 腹水。抗体浓度 0.5-5mg/ml 。按 1ml/ 管，用 1.5mlEP 管分装后放 -80 冻存。5.抗体纯化(1) ProteinG 亲和层析柱准备 : 填料（ 1ml）装柱后，超纯水流洗 3-5 个柱床体积以洗掉乙醇，用平衡缓冲液洗 5-10 个柱床体积平衡柱子。(2) 上样：将样品上柱，上柱前需将样品超滤浓缩至1ml 上柱。(3) 洗涤：平衡缓冲液洗 5-10 个柱床体积，直至洗涤液用检测液检测无明显显色反应为止。(4) 洗脱：洗脱缓冲液洗脱吸附在填料上的目标抗体，收集洗脱峰 (1-6 管) ，洗脱液立即用中和缓冲液中和到中性。(5) 平衡层析柱：立即用 5-10 个柱床体积平衡缓冲液平衡柱子到中性。(6) 再生：再生缓冲液流洗 2-3 个柱床体积。(7) 保存：先后用平衡缓冲液、 20%乙醇分别流洗 3-5 个柱床体积。层析柱内保留适当体积的 20%乙醇，置于 48保存。
腹水抗体制备一般流程
