基因工程制药pa课件

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1、基因工程制药pa 基因工程菌的培养方式和培养设备 基因工程药物的分离纯化工艺五、基因工程菌的培养和分离纯化技术基因工程制药pa基因工程药物的分离纯化 目的产物在初始原料中的含量较低；含目的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还有大量的细胞、代谢、残留物培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大。目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易使其失活、变性。基因工程制药pa基因工程药物的分离纯化 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂 的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质。应用面广，对其质量、纯

2、度要求高，甚至要求无菌、无热源。基因工程制药pa基因工程药物的分离纯化建立分离纯化工艺的根据 含目的产物的起始物料的特点 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的 各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。菌体类型及其代谢特征：包括菌体的生物学性质，产物和 副产物种类、产物在细菌内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解 产物的酶类等；原材料和培养基的来源及其质量；基因工程制药pa基因工程药物的分离纯化建立分离纯化工艺的根据 生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等；初始物料

3、的物理，化学和生物特性：包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、流体力学性质和热力学性质。基因工程制药pa基因工程药物的分离纯化 物料中杂质种类和性质 物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。目的产物特性 产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分 子量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和 性、配基种类、表面活性等。基因工程制药pa基因工程药物的分离纯化 产品质量的要求 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比

4、活的要 求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类 和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳4.定性等。基因工程制药pa分离纯化的基本过程 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括 细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯化以及成品加工。基因工程制药pa基因工程制药pa基因工程制药pa分离纯化的技术分离纯化技术要求：技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；收率要高；两个技术之间要

5、能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。基因工程制药pa1.细胞破碎与固液分离 细胞收集：离心和膜过滤 细胞破碎：机械法-高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。非机械法-酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和膜 过滤。基因工程制药pa2.目的产物的分离纯化 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术分为：Ion exchange chromatography（IEC）Reversed phase chromatography（PRC）Hydrophobic interacti

6、on chromatography（HIC）Affinity chromatography（AC）基因工程制药pa等电点等电点决定离子交换的种类及条件决定离子交换的种类及条件疏水性疏水性与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度特殊反应性特殊反应性产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制聚合性聚合性是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体生物特异性生物特异性决定亲和配基决定亲和配基溶解性溶解性决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度稳定性稳定性决定工艺采用的温度及流程时间决定工艺采用的温度及流程时间微不均一性微不

7、均一性影响产物的回收影响产物的回收基因工程制药pa基因工程制药pa分离纯化工艺应遵循的原则 具有良好的稳定性和重复性；尽可能减少组成工艺的步骤；组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺和设备相适应。在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量；基因工程制药pa分离纯化工艺应遵循的原则 分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性差的产物；工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低；具有较高的安全性基因工程制药pa针对不同的产物表达形式采用不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处

8、理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合性战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲合层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。基因工程制药pa针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（pI5或 pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-810-4 mol/L）；基因工程制药pa针对不同性质的重组蛋白选择不同的层

9、析类型 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。基因工程制药pa多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：u 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用u 应首先选择能除去含量最多杂质的方法u 应尽量选择高效的分离方法u 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段基因工程制药pa分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模

10、产业化过程未必合适，如：u 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）u 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺基因工程制药pa包含体的形成：原核、酵母和真核生物由于异源和同源蛋白过表达所形成的致密的不溶性颗粒。包含体的形成与过表达蛋白的内在性质（如分子量、折叠途径等）无直接关系。因为大肠杆菌胞质环境是一个还原性环境，所以含有较多二硫键的蛋白较容易错误折叠形成包含体。相比之下，周质空间有利于二硫键的形成，但是包含体的形成也会发生。包含体的产生有利有弊。基因工程制药pa包含体的性质：致密；折光性；组成（几乎全部都是过表达蛋白，杂质

11、主要是细菌外膜蛋白，离心时一起沉降）；通常对蛋白酶降解不敏感（发酵升温至42可促进包含体形成并进一步抑制蛋白酶）基因工程制药pa 分离包含体并复性蛋白质的操作步骤并不复杂，从破碎细胞开始，然后将细胞匀浆离心，回收包含体后，加入变形剂溶解包含体，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。但在实际研究中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在错误折叠和聚合，复性效率往往很低。究其原因，蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。基因工程制药pa一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用。一是分子内的疏水相互作用

12、，二是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高复性收率的关键。基因工程制药pa细胞破碎效率较重要（溶菌酶处理高压匀浆）固-液相分离（离心）去污剂或/和低浓度尿素或盐酸胍洗涤，去可溶性蛋白和膜蛋白高浓度尿素或盐酸胍溶解包含体，可添加DTT(二硫苏糖醇)打开二硫键逐步透析或稀释去除变性剂基因工程制药pal 透析或稀释速度，温度，pH，离子强度，目的蛋白的浓 度（通常10-100微克/ml）以及目的蛋白中的杂质会影响 复性过程，甚至导致目的蛋白聚集沉淀。l

13、对含有二硫键蛋白，采用谷胱甘肽、半胱氨酸和巯基乙胺 （cysteamine）等还原剂打开二硫键，使用过量的氧化硫氨 试剂或铜离子诱导的空气氧化可以加速二硫键氧化形成。复性过程添加L-精氨酸有时可以大幅度提高复性效率，可 能是由于增加了复性中间体的可溶性。l 复性过程添加某些去垢剂可以提高复性效率。l 通过抑制分子间非特异性的相互的另一方法是使蛋白固定化 （在亲和层析柱上复性）。基因工程制药pal 避免或减少包含体形成的有效方法是减缓蛋白合成速率，如降低发酵温度、使用弱启动若启动子、降低基因剂量等。l 使用亲水性蛋白作为融合伴侣可以增加融合蛋白的可溶性，如谷胱甘肽硫转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋

14、白（MBP）和硫氧化还原蛋白（thioredoxin）后两者还具有分子内伴 侣作用，在细胞内过表达分子伴侣蛋白，促进外源蛋白的 正确折叠。l 过表达二硫键异构酶可以促使蛋白的正确折叠，大肠杆菌 周质空间的DsbA蛋白的作用是引入新的二硫键，但是不催 化异构，DsbC是一种二硫键异构酶。l 在培养基中加入硫醇也可以促进打开错配的二硫键，形成正 确的折叠蛋白。基因工程制药pa分子大小分子大小凝胶过程凝胶过程分辨率适中；分级分离式流速分辨率适中；分级分离式流速较慢（较慢（8h/循环）脱盐时流循环）脱盐时流速快（速快（30min/循环）；容量受循环）；容量受限于样品体积限于样品体积分级分离、适于脱盐，

15、大规分级分离、适于脱盐，大规模纯化的最后一步、用于去模纯化的最后一步、用于去除杂质的聚合体；脱盐可用除杂质的聚合体；脱盐可用于任何阶段、特别是步骤衔于任何阶段、特别是步骤衔接时的缓冲液更换接时的缓冲液更换电荷电荷离子交换离子交换分辨率通常较高；流速较快分辨率通常较高；流速较快（合适的填料）；容量很大，（合适的填料）；容量很大，样品体积不受限样品体积不受限最适于早期纯化，即大体积最适于早期纯化，即大体积样品且蛋白纯度较低时使用样品且蛋白纯度较低时使用等电点等电点色谱聚焦色谱聚焦分辨率较高；流速大；容量大，分辨率较高；流速大；容量大，样品体积不受限样品体积不受限纯化最后阶段纯化最后阶段疏水特性疏水

16、特性疏水作用疏水作用分辨率较高；流速大；容量大，分辨率较高；流速大；容量大，样品体积不受限样品体积不受限适于任何阶段，特别适于样适于任何阶段，特别适于样品离子强度较高，如沉淀，品离子强度较高，如沉淀，离子交换后离子交换后反相反相分辨率较高；流速很快；容量分辨率较高；流速很快；容量大大适用于最后阶段；特别适于适用于最后阶段；特别适于分子量较小的肽分子量较小的肽生物亲和性生物亲和性亲和亲和分辨率极高；流速大，容量大，分辨率极高；流速大，容量大，样品体积不限样品体积不限适于任何阶段，特别是样品适于任何阶段，特别是样品浓度小，杂质含量多时使用浓度小，杂质含量多时使用基因工程制药pa层析分离技术（chr

17、omatography）层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法目前最常用的层析方法 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析基因工程制药pa离子交换层析 离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换层析的基本操作离子交换介质的选择原则基因工程制药pa离子交换层析的基本原理离子交换层析（ion-exchange chromatography，IEC）IEC是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异，在离子吸附剂上静电吸附能力不同，用不同的pH/离子强度洗脱液洗脱，从而使蛋白质分离的柱层析方法。离子交换

18、层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。基因工程制药pa通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白基因工程制药pa离子交换介质的基本性质u 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分 子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等。u 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中 的其它阳离子或阴离子起交换作用u 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用 洗脱液洗脱时各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的 平衡常数离子交换剂的

19、基本性能基因工程制药pa离子交换介质的基本性质u吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋 白质失去电荷而解离下来u 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即 亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可 将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的离子交换剂的基本性能基因工程制药pa离子交换介质的基本性质u 阳离子交换剂：强酸性和弱酸性 可电离的基团 磺酸基（-SO3H）磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）酚羟基（-OH）u 阴离子交换剂：强碱性和弱碱性 可电离的基团 伯胺基（-NH2）仲胺基（-NHCH3）叔胺基（-N(CH3)2）季胺基（-N+(CH3)3）

20、离子交换剂的分类基因工程制药pa离子交换介质的基本性质强离子交换剂 的电离率基本不受pH值影响，在整个pH范 围都是离子化的，离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂 的电离率受pH影响大，通常仅在pH69之间 是离子化状态，离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂 在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂 在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱离子交换剂的分类基因工程制药pa离子交换介质的基本性质u 离子交换树脂 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物u 离子交换树脂的优点 流速快，对小分子物质的

21、交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化常用的离子交换剂基因工程制药pa离子交换介质的基本性质离子交换纤维素 离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）常用的离子交换剂基因工程制药pa离子交换介质的基本性质离子交换葡聚糖 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔性三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex

22、 G）Sephadex 的优点l 亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白 质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小l 电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快l 既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而Sephadex 是一类广泛应用的色谱分离介质常用的离子交换剂基因工程制药pa离子交换介质的基本性质常用的离子交换葡聚糖包括阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25,CM-Sephadex C-50 Sephadex C-25,Sephadex C-50阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25,DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephad

23、ex A-25,QAE-Sephadex A-50常用的离子交换剂基因工程制药pa离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖是携带DEAE 或CM 基团的Sepharose CL-6B DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因而具有稳定的外形体积基因工程制药pa离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换琼脂糖：Sepharose Fast Flow 分类类型强度功能基团阴离子交换DEAE中等-OCH2+CH

24、2NH(CH2CH3)2QAE强-OCH2+CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3阳离子交换CM弱-OCH2COO-SP强-CH2CH2CH2SO3-基因工程制药pa离子交换介质的选择原则选择 根据蛋白质的等电点选择介质 根据分离目的选择介质 酸性物质用 交换剂分离 碱性物质用 交换剂分离 氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化曲线来选择阴离子阳离子基因工程制药pa离子交换介质的选择原则对Pi=5的酸性蛋白质当蛋白质为阴离子时在pH 5.5-9.0 的范围内应首选 DEAE-纤维素当蛋白质为阳离子时在pH 3.5-4.5 的范围内应首选CM-纤维素基因工程制药pa离子交换

25、层析的基本操作层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要基因工程制药pa离子交换层析的基本操作样品进柱 为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高。交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数基因工程制药pa离子交换层析的洗脱 在洗脱方式上，阳离子交换主要是改变pH，它主要应用于等电点大于5的蛋白质，而阴离子交换主要是改变盐浓度，适用于大部分蛋白质。IEC 的洗脱一般分为3种 同步洗脱 分步洗脱 梯度洗

26、脱基因工程制药pa离子交换层析需注意的问题缓冲液的选择 阳离子：Tris 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐介质处理 阳离子：Na+型 阴离子：Cl-型洗脱 原理：改变盐浓度 改变pH 方式：连续洗脱 梯度洗脱介质再生基因工程制药pau 20种氨基酸中，大部分带正电荷或负电，这是IEC应用 范围广的原因。u IEC处理量大，附载系数高，一步缩小样品体积很多。u IEC去除杂质能力强，如对热原质、核酸、外毒素、小牛 血清中大部分蛋白及电荷性有差别的蛋白均可去除u 利用蛋白在不同pH和盐浓度下带电性的不同，通过不同 条件下应用同种类或不同类型介质（如DEAE、CM），分两步IEC使目标蛋白达到提纯目的，这是

27、除亲和柱层 析外，别的柱层析达不到的分离能力。基因工程制药pau IEC原则上讲可放在纯化工艺的任何一步，他属吸附型 层析，单步损失也较大。扩大纯化工艺时，尤其要按放 大直径考虑，而不能只单独放大柱高。一般来说柱高不 能大于柱直径的4倍，否则纯化结果和小试会相差较多。基因工程制药pa亲和层析 AC 具有分离纯化目标单一，回收率很高的特点。从理论上来讲，AC得到的是相当纯的物质，这种分离纯化能力是其他任何柱层析都难以相比的。AC柱制作工艺复杂，同时在色谱洗脱过程中配体不可避免的脱落，不但柱子的使用寿命有限，而且必须经特别处理才可以注射或服用，因此成本比较昂贵，一般不放在纯化工艺的前面基因工程制药

28、pa疏水层析 疏水作用柱层析（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）HIC 是以蛋白质的疏水性为分离基础的。具体说就是一种通过表面疏水性的差异来分离蛋白质的柱层析方法。疏水键的形成对于非极性双方无特异性要求，不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱顺序为：Trp、ILe、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。基因工程制药pa疏水层析 影响HIC的因素当介质和上样蛋白质浓度不变时，主要有：盐类：其作用是使暴露出界面的非极性基，使

29、容易形成疏水作用，其次是增加水相极性，提高界面的表面张力，盐浓度越高，促疏水盐为(NH4)2SO4。混溶有机溶剂：作用是使界面张力减弱，减少疏水作用 基因工程制药pa疏水层析 影响HIC的因素 温度：当体系温度由4升高到25时，疏水作用力增加20%30%，这主要是由于动能增加，提高表面张力，一般当温度降低，可增大盐浓度，使疏水作用不降低。pH：当pHPI 时可消除表面电荷的相斥作用。表面活性剂 变性剂基因工程制药pa疏水层析 HIC 使用范围广，原则上可用于所有蛋白质纯化，处理量大，特别是从大体积样品中提取含量的目标蛋白显优势，可取代传统的盐析沉淀技术。HIC对DNA及小牛血清（其中的白蛋白、

30、免疫球蛋白、氨基酸等成分）去除率较高，尤其对细胞DNA一步去除率可达到90%以上。原则上HIC可放在纯化工艺的任何位置，但大部分放在前面。由于它属于吸附型柱层析，尤其是对蛋白质空间内部的疏水作用可使此步损失较大，对蛋白质的结构也有细微的作用。基因工程制药pa金属螯合层析 金属螯合层析（Immobilozed Metal Ion Affinity Chromatography，IMAC）IMAC是根据蛋白质中组氨酸等氨基酸残基和介质中特殊金属离子进行金属螯合作用，形成络合物以分离蛋白质的柱层析方法。蛋白质表面暴露出一定的氨基酸残基（His、Cys、Try）是蛋白质吸附所需要的。蛋白质侧链空间排列

31、方式起重要作用，如电荷、分子体积、氨基酸组成等分子性质相似，但二级和三级结构不同的蛋白质基因工程制药pa金属螯合层析 层析中的单纯的离子吸附和其他的一些复杂因素可以减少或通过高离子强度的缓冲液进行改善，螯合作用受pH可解析已吸附的物质，但也有一些例外。在IMAC中可应用几种洗脱方式，如pH梯度洗脱、竞争配体洗脱、有机溶剂洗脱、螯合剂洗脱。IMAC纯化蛋白质时，金属与蛋白质表面暴露的氨基酸残基作用。IMAC在分离相应的蛋白质时，分离率和回收率也高，它一般放在纯化工艺的中后期。某些蛋白质、氨基酸和一些金属离子的特异亲力举例如下：Cu同含氮化合物，单核苷酸，人乳铁蛋白；Ni同含酪氨酸，色氨酸的蛋白质

32、或多肽；Zn同含组氨酸、半胱氨酸的蛋白质或多肽。基因工程制药pa浓缩、干燥及保存 蛋白质的浓缩 减压加温蒸发浓缩 空气流动蒸发浓缩 冰冻法 吸收法 超滤法 沉淀法基因工程制药pa浓缩、干燥及保存 干燥真空干燥适用于不耐高温、易于氧化物质的干燥和保存。整个装置包括干燥器、冷凝器及真空泵三部分。干燥器内常放一些干燥剂如五氧化二磷、无水氯化钙等。冷冻真空干燥除利用真空干燥原理外，同时增加了低温因素。先将待干燥的液体冷冻到-20-40，使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂升华成气体而除去。既能在低温条件下保护样品在干燥过程中不会失活，又避免了液态样品在低压下因溶剂迅速气化而产生大量气泡的损失基因工程制

33、药pa浓缩、干燥及保存 保存 生物大分子的稳定性与保存方法有很大关系。其保存可分为两种：干粉 液态 但不论是干粉或液态都应避免长期暴露于空气中防止微生物的污染。温度对生物大分子的稳定性和生物活性影响很大，故一般生物大分子都在低温（04）保存时间也不宜过长，否则会招致样品的失活。基因工程制药pa浓缩、干燥及保存 干燥后的制品 性质一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保存在04冰箱即可。为了取样方便和避免取样时吸潮和被污染，可先将样品分装成小瓶，每次用时只取出一小瓶。基因工程制药pa浓缩、干燥及保存 液态贮藏

34、这种方法对保持生物大分子活性是不利的，有些样品在溶液中会较短的时间内分解或失活，液态保存时应注意以下几点：样品不能太稀 一般需加入防腐剂和稳定剂 贮藏温度要严格按照要求，绝对不能乱放，有些样品只能贮藏于04冰箱，有些可贮藏于-20冰箱，有的可贮藏与-80冰箱甚至液氮中，应视不同物质而定。基因工程制药pa蛋白质的定量 蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量相差很大，功能各异，要建立一个理想而又通用的蛋白质定量测定的方法是很困难的。下面列出根据其不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质 紫外分光光度法化学性质 凯式定氮法、双缩脲法、Lowry法、BCA法、胶 体金法染

35、色性质 考马斯亮蓝染色法、银染法其他性质 荧光法基因工程制药paDNA、RNA的定量 用紫外分光光度计测定260nm和280nm两个波长的光吸收，然后，按1A260相当于50 g/ml双链DNA、40 g/ml单链DNA或RNA及20g/ml单链寡核苷酸，计算样品含量。260nm和280nm两处读数的比值（A260/A280），可反映核酸的纯度。DNA和RNA 纯品的A260/A280值分别为1.8和2.0，如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A260/A280将明显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。基因工程制药pa蛋白质的鉴定 n 浓度鉴定n DNA、RNA 的定量n 纯度鉴定n

36、分子量测定n 等电点测定n 活性测定基因工程制药pa蛋白质的鉴定 纯度鉴定电泳法：SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳)，IEF(等点聚焦电泳)化学法：N-端测定，C-端测定仪器法：HPLC，质谱，氨基酸组成分析分子量测定SDS-PAGE凝胶过滤氨基酸组成分析毛细管电泳基因工程制药pa蛋白质的鉴定等电点测定等电聚焦电泳活性测定激酶：标记ATP磷酸化酶：定磷利用靶酶活性氧化还原酶ELISA（酶联免疫吸附剂测定）基因工程制药paGM-CSF 下游生产工艺流程基因工程制药pa一、原材料的质量控制 确保编码药物的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品

37、的质量的安全性和一致性。明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶图谱和核苷酸序列等予以确证；提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分（如启动子、复制子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志物；六、基因工程药物的质量控制基因工程制药pa 提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因表达载体两侧端控制区的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。六、基因工程药物的质量控

38、制基因工程制药pa二、培养过程的质量控制 在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。生产基因工程菌产品应有种子批系统，并证明种子液不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库；原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性；六、基因工程药物的质量控制基因工程制药pa 对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿

39、主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特性；以宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品；培养周期结束时，应检测宿主细胞载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。六、基因工程药物的质量控制基因工程制药pa三、纯化工艺中的质量控制 1、产品要有足够的生理和生物学试验数据，确保提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热原质都控制在规定限度以下。2、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有

40、检测方法。四、目标产品的质量控制1、产品的鉴别六、基因工程药物的质量控制基因工程制药pa表 重组蛋白质药物产品常用的鉴别方法电泳方法：SDS-PAGA，等电聚焦，免疫电泳免疫学方法：RIA，RID ELISA，Immunoblotting受体结合实验（Receptor Binding）各种高效液相分析法（HPLC）肽图分析法Edman N末端序列分析法园二色谱（CD）NMR六、基因工程药物的质量控制基因工程制药pa 肽图分析法 氨基酸成分分析 部分氨基酸序列分析：N-端15个氨基酸 重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定 蛋白质二硫键分析2、纯度分析 目的蛋白质含量测定 杂质：分蛋白类杂质和非

41、蛋白类杂质。见表X3、生物化学测定4、稳定性考察5、产品一致性的保证六、基因工程药物的质量控制基因工程制药pa表x 基因工程产物常见杂质和污染物及其检测方法基因工程制药pa五、产品的保存1、液态保存 低温保存：液态蛋白质样品在-10-20 以下冰冻保存。在稳定性pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点，且多数蛋白质只有在很窄的pH范围内才能稳定。因此对保存液态蛋白质样品时小心调到其稳定的pH范围内。高浓度保存：一般蛋白质在高浓度时比较稳定，因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，浓度太低易引起亚基解离和表面变性 加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇、二硫苏糖醇等。六、基因工程药物的质量控制基因工程制药pa2、固态保存 一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定，但在37保存时活性明显下降。长期保存蛋白质的最好方法是支撑干粉或结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性，放在干燥器中在4可保存相当长的时间。六、基因工程药物的质量控制基因工程制药pa