血清蛋白的分离PPT课件

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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法(1)学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板及圆盘电泳的操作技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N甲叉双丙烯聚酰胺(Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的,但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺(Ap),催化剂是四甲基乙二胺(TEMED);光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺,在紫外光照射下引发自由基团。聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶体

2、系有连续和不连续电泳之分。不连续电泳系统由浓缩胶和分离胶两种胶体组成,两种胶体分别由不同的pH 的缓冲液和胶贮液配制而成,形成孔径不同的两种胶体。不连续电泳系统电泳分离过程中包括三种物理效应,即样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛效应。本次试验采用不连续电泳系统PAGE,通过三种效应将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进行分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳有圆盘电泳和垂直板电泳之分,但两者的原理完全相同,只是所用的电泳槽不同。由于时间问题,本次试验将分两组进行,一组使用圆盘,一组使用垂直板。夹心式垂直板电泳槽,圆盘电泳槽,电泳仪,直流稳压电源,玻璃板(1313),注射器及微量注射器

3、抽气泵,干燥器,培养皿,玻璃棒,吸量管,烧杯,滴管,玻璃管,薄膜手套,滤纸,日光灯制备分离胶、浓缩胶有关试剂:凝胶缓冲液,分离胶贮存液,0.8%过硫酸铵;浓缩胶缓冲液,浓缩胶贮存液,40%蔗糖溶液,核黄素。Tris-甘氨酸电极缓冲液(PH8.3)已加入溴酚蓝指示剂的血清样品染色液(氨基黑)1%琼脂(糖)溶液脱色液(7%乙酸溶液)由学生自己配制一、垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳1.凝胶的制备:(1)安装夹心式电泳槽 将长短玻璃板分别插到U形硅橡框的凹形槽中(注意勿用手接触灌胶面的玻璃),在长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼脂糖(其目的是封住空隙,凝固后的琼

4、脂中应避免有气泡),琼脂凝固后,将硅胶橡框装入电泳槽内,以对角线的方式将螺丝帽旋紧。试剂名称试剂名称 用量(用量(ml)分离胶缓冲液(ph8.9)2.5ml 分离胶凝胶贮液 5.0ml 蒸馏水 2.5ml将以上三种试剂混合均匀后,置于真空干燥器中 抽气10min过硫酸铵,置于真空干燥器中,抽气10min 10.0ml按上表格配胶,二者抽气后混合均匀,小心不要在溶液中搅出气泡,以免过多接触空气。迅速用滴管将混合后的分离胶装在二块玻璃板之间至短板上端约3-4cm,并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面,(注意加水时,不要引起胶面的大波动)。在室温中放置,当两界面出现不同折射率时表

5、明已凝胶,时间大约40 分钟,以出现折射率不同的界面为准,再室温下放置十分钟,使凝胶充分。将分离胶上层的水倒去,再用滤纸吸去多余的水(注意不要碰破胶面),为下一步做准备。试剂名称试剂名称用量(用量(ml)浓缩胶缓冲液(ph6.7)0.5ml 浓缩胶贮液 1.0ml 40%蔗糖 2.0ml将以上三种试剂混合均匀后,置于真空干燥器中,抽气10min 核黄素 0.5ml按上表所示配胶,抽气后加核黄素0.5ml,混匀,立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上端约0.5cm,插入加样梳,放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶,3050分钟左右凝好(凝缩胶变为乳白色为准),凝好后小心拔去加样梳。将

6、Tris甘氨酸电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的左、右槽中,短玻板一侧要稍微超过玻板,长玻板一侧只要越过电泳丝的高度。用微量注射器通过缓冲液在每个加样凹槽中加入约5ul的样品。将样品端(短玻璃的一边)接直流稳压电泳仪的负极,接通冷却水,开始电泳。开始时电流控制在10mA,待样品进入分离胶时,将电流调至30mA左右。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘琼脂界面处0.5cm 左右时,电泳完成。将缓冲液回收至试剂瓶中,还可用1-2 次(注意将正负级的缓冲液分开回收)。4.剥胶 将固定螺丝旋松,取出硅橡胶框,将一块玻璃板轻轻剥开,然后用玻璃棒将胶板取下放入培养皿中。5.固定,染色 在培养皿中倒入氨基黑染

7、色液至覆盖胶板,染色分钟左右,此时染色与固定同时进行。(染色液要回收利用)6.脱色 用 7%乙酸浸泡数次,直至背景蓝色脱去。1.凝胶的制备:(1)安装圆形玻管 将洗净的玻璃管烘 干后用橡胶玻璃头封 严,放置在一边等待 灌胶。(2)分离胶制备 按垂直板的方案进行配胶,混匀后迅速用滴管分装在玻璃管中至玻璃管上端约2-3cm,并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面,在室温中放置,当两界面出现不同折射率是表明已凝胶,将分离胶上层的水倒去,再用滤纸吸去多余的水(注意不要碰破胶面),为下一步做准备。(3)浓缩胶制备(同垂直板):按垂直板的方案进行配制,配制好后,立即加入到已配制好的分离胶

8、上面至短玻璃板上端约1cm,然后放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶,3050 分钟左右凝好(凝缩胶变为乳白色为准)。2.加样将 电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的上.下槽中(注意需没过玻璃管的上下端),用微量注射器通过缓冲液在每个玻璃管的凝胶表面加约5ul 的样品3.电泳将样品端(上槽)接直流稳压电泳仪的负极,下槽接直压电泳仪的正极。开始时电流控制在1-2mA/管,待样品进入分离胶时,将电流调至5mA 左右/管。当蓝色染料迁移至距离玻璃管下缘1-2cm 左右时,停止电泳。将缓冲液回收至试剂瓶中(注意正负极分开回收)。4.剥胶将玻璃管从电泳槽中取下,用注射器吸满自来水后将针头插到凝胶

9、与管壁之间,推动注射器,使针头在管壁和胶之间前进,胶条在水的压力及润滑的作用下自玻管中脱出,将其放入培养皿中。5.固定,染色,脱色(同垂直板)由于与凝胶集合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净,在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离,产生气泡或滑胶;剥胶时凝胶板易断裂,为防止此现象,所用器材均应严格地清洗。安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时,位置要端正,均匀用力旋紧固定螺丝,以免缓冲液渗漏。用琼脂(糖)封底及灌凝胶时不能有气泡,以免影响电泳时电流的通过。灌胶时,若担心琼脂封底不牢固,则可在上、下贮槽中倒入蒸馏水,液面上面不能超过上贮槽的短玻璃板,防止蒸馏水进入凝胶中。其作用是增加压力,防止凝胶液渗漏。浓缩胶凝胶完全聚合后,必须放置30min左右,使其充分“老化”后,才能轻轻取出样品槽模板,切勿破坏加样凹槽底部的平整,以免电泳后扭曲(凝胶加“老化”整个过程用时大约50分钟)。电泳时,电泳仪与电泳槽间正负极不能接错,以免样品反方向泳动。电泳后,应分别收集上、下贮槽(正负极)电极缓冲液,切不可混合回收。染色液要及时回收。垂直板电泳结果:圆盘电泳结果:谢谢大家!祝大家试验成功!

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